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只７２７．３单位代码：１０３６４：分类号２７２０２密難学弓１１１：会後足茲义當学位论文油茶果实形态解剖及生理特性与炭捏病的关系民ｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｍｏｒｐｈｏｌｏ，ａｎａｔｏｍｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅｇｙｔｔｉｃａｌｃｈａｒａｃ／＇ｏ献ｆｃ＆ｗｍ－ｃｈａｒａｃｅｒｉｓｉｃｓｈｙｓｉｏｌｏｂｒｉｓｔｉｃｓａｎｄＣｏ／，ｐｇｇｌｏｅｏｓｐｏ的ｏｉｄｅｓ姑Ｃａｍｅｌｌｉａｏｌ幻ｆｅｒａｆｍｉｔ研究生：沈雅飞指导教师：巧庆龙教投申请学位口类级别：农学硕壬专业名称：园林植物与观赏园艺，研究方向：园林枯物栽培所在学院：林学与同林学院答辩委员会主席：２０１５年６月？，一■ 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导Ｋ进行的研究Ｔ－作及取巧的研，论文中不包含巧他，究成果。尽我所知除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得安徽农业乂学或教育机构的学．化或证书冊使用过的材料。与我同了作的同志对本硏究所做的任何贡献均己在论义中作了明确的说明并表示了谢意。？年月口：拥Ｉ知时邮＞￡化硏究化签名雌化＾＾关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业乂学有关保留、使用学位论文的规沾，即：学校巧权保留送交论文的复印件和撼盘，允许论文被宵阅和借阅，可Ｌ义采用影印、缩印或巧描等复制手段保存、汇编学位论丈。同盧安徽农业人学可＾心用不问义式么不Ｗ媒傅上发表、传播学位论文的全部戍部分内巧。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研■曰究生签名：时间：年片分巧＾导１１巾签名：為咖：訓年户月公口和长 摘要本研究于油茶炭疽病发生盛期，在没有进行任何防治的油茶纯林中，选择不同果实类型的油茶植株，调查统计其果实的炭疽病发病率，测定不同抗病类型果实形态解剖及果皮的生理特性，探究其与炭疽病发病率的关系，以期从中筛选出油茶抗病性较稳定的相关性状，为选育抗病良种提供理论依据。主要结果如下：1.在所采的样果中，油茶果实的主要颜色有纯青色、栗红色、青红色、青黄色和麻青色，分别占样果的7.9%、14.8%、30.6%、42.1%和4.6%，果实的形状主要划分为球形、卵形、橄榄形和桔形，分别占样果的29.0%、34.0%、17.0%和20.0%。2.不同抗感类型的果实横径范围为2.58cm-3.53cm，高抗类型（两个高抗类型的均值）的最大，高感类型最小，果实横径随着果实抗病的减弱依次呈减小的趋势；果实纵径的变化趋势与横径的类似；果实的大小、鲜重和面积均随着感病程度的增加呈现减小的趋势。3.不同抗感类型的油茶果皮的总厚度、蜡质层、角质层和薄壁组织的厚度，均以高抗类型为最大(5.33×103μm、35.68μm、25.85μm、87.73μm），高感类型为最小（2.77×103μm、19.33μm、9.67μm、48.33μm）；随着油茶果实抗病性增强，果皮气孔开度、密度和单位气孔面积均呈现明显的下降趋势，以高感类型为最大（38.58μm2、22.02个•mm-2、670.50μm2），高抗类型最小（12.59μm2、5.05个•mm-2、82.21μm2），但气孔大小与炭疽病抗性没有明显相关性；抗病类型的油茶果皮表皮毛长度、粗度和密度，均明显大于感病类型。油茶果皮解剖结构与炭疽病抗性关系极为密切，可以作为鉴定油茶炭疽病抗性强弱的参考指标。4.果皮的pH值和相对电导率均随着果实抗病性的增强，表现出缓慢降低的趋势，以高感类型为最大（4.94%、36.00%），高抗类型最小（4.01%、26.00%）；果皮单宁、花青素、可溶性糖含量和PAL活性随着果实抗病性的增强，表现出增加的趋势，以高抗类型最大（4.16%、22.75mg/g、2.37%、48.33U•g·min-1），高感类型为最小（1.66%、16.74mg/g、1.35%、28.67U•g·min-1）。5.相关分析表明，炭疽病发病率与果实颜色、形状呈正相关（R=0.7626和0.7335），与果实大小、横径、纵径、重量和面积呈负相关（R=-0.6451、-0.6335、-0.6335、-0.1684和-0.5343），其中，发病率与形状和果实面积相关性较弱，果色与发病率呈显著正相关（R=0.7626）。发病率与相对电导率呈极显著正相关(R=0.8370)，与pH值呈显著正相关(R=0.7065)，与花青素含量和PAL活性呈极显著负相关(R=-0.8202和-0.8251)，与单宁含量和可溶性糖含量相关性较弱（R=-0.1468和-0.3223）。I 6.通径分析表明，所测形态和生理生化指标对发病率的作用效应依次为果色＞大小＞形状＞横径＞面积＞鲜重＞纵径；相对电导率＞pH值＞PAL活性＞花青素含量＞可溶性糖含量＞单宁含量。关键词：油茶炭疽病；形态学性状；果皮结构；生理特性；通径分析II AbstractDifferentfruittypesofC.oleiferainthebloomingperiodofanthracnosewerechosenasexperimentalmaterialsintheabsenceofanypreventionC.oleiferapureforest.Thentheirincidencewasinvestigated.Themorphologycharacteristicspeelstructure,physiologicalandbiochemicalcharacteristicswerealsostudied,toexploretheirrelationshipstoanthracnose,andtoselectthebetterresistancetraitwithanthracnoseincidenceofC.oleifera,aswellastoprovideatheoreticalbasisforbreedingdisease-resistantvarieties.Theresultsareasfollows:1.BasedonthecoloroffruitpeelinCamelliaoleiferafieldweregroupedintofivetypesofpurecyan,chestnutred,greenred,greenyellowandlinencyan.Thescaleswererespectively7.9%,14.8%,30.6%,42.1%and4.6%.Atthesametime,theshapesoffruitweregroupedintofourtypesofspherical,ovoid,ovalandorange-shaped.Thescaleswererespectively29.0%,34.0%,17.0%and20.0%.2.ThemainmorphologycharacteristicsofC.oleiferawithdifferentinfecteddegreestypewaresignificantlydifferent.Therangeoffruittransversediameterwas2.58cm-3.53cm.Diseaseincidencewiththefruittransversediameterwasextremelysignificantlycorrelated.ThefruittransversediameterwasincreasedwithC.oleiferafruitsenhanceddiseaseresistance,whilethesameaslongitudinaldiameteroffruit.Fruitsize,freshweightandareaareshowedadecreasingtrendwithincreasedincidencedegree.3.Resultsshowedthatthethicknessofpeel,wax,laminacorneumandparenchymaofhighly-resistancetypewereallthehighest(5.33×103μm,35.68μm,25.85μm,87.73μm),andthoseindexesofhighly-susceptibletypewerethelowest(2.77×103μm,19.33μm,9.67μm,48.33μm).ThestomataaperturedensityandunitareaofstomaweredecreasedwithC.oleiferafruitsenhanceddiseaseresistance.Thoseindexesofhighly-susceptibletypewerethehighest(38.58μm2,22.02persquaremillimeter,670.50μm2),thehighly-resistancetypeswerethelowest(12.59μm2,5.05persquaremillimeter,82.21μm2).However,therewasnosignificantdifferencebetweenthesizeofstomaandthediseaseresistance.Theepidermalhairslength,roughnessanddensityoftheresistancetypewereallhigherthanthesusceptibletype.ResultsshowedthattherewasanextremelycloserelationshipbetweenthepeelstructureandanthracnoseresistanceofC.oleifera,whichcanbeasareferenceindextoappraisalanthracnoseresistanceofC.oleifera.III 4.ThepHvalueandtheconductivityweredecreasedwithC.oleiferafruitsenhanceddiseaseresistance.Thoseindexesofhighly-susceptibletypewerethehighest(4.94%,36.00%),thehighly-resistancetypeswerethelowest(4.01%,26.00%).Thetannincontent,anthocyanincontent,solublesugarcontentandPALactivitywereincreasedwithC.oleiferafruitsenhanceddiseaseresistance.Thoseindexesofhighly-susceptibletypewerethehighest(4.16%,22.75mg/g,2.37%,48.33U•g·min-1),thehighly-resistancetypeswerethelowest(1.66%,16.74mg/g,1.35%,28.67U•g·min-1).5.Resultsshowedthatthediseaseincidencewiththefruitcolorandshapewarepositivecorrelatedwithcorrelationcoefficient0.7626and0.7335,whilethefruitsize,transversediameter,longitudinaldiameter,weightandareaoffruitwarenegativecorrelatedwithcorrelationcoefficient-0.6451,-0.6335,-0.6335,-0.1684and-0.5343.Amongthoseindexesthediseaseincidencewiththefruitcolorandshapewaresignificantlypositivecorrelated,whilethepHvalueandtheconductivitywareextremelysignificantlypositivecorrelated.Atthesametime,theanthocyanincontentandPALactivitywereextremelynegativecorrelatedwithcorrelationcoefficient-0.8202and-0.8251.6.Thoseindexesmadeobviouscontributiontodiseaseincidence.AmongmorphologycharacteristicsofC.oleiferafruits,fromsmalltolargewarefruitcolor,fruitsize,fruitshape,transversediameter,fruitarea,fruitweightandlongitudinaldiameter.Atthesametime,amongphysiologicalandbiochemicalcharacteristics,fromsmalltolargewaretheconductivity,pHvalue,PALactivity,anthocyanincontent,solublesugarcontentandtannincontent.Keywords:anthracnose;morphologycharacteristics;peelstructure;physiologicalandbiochemicalcharacteristics;pathanalysisIV 目录1文献综述....................................................................................................................11.1油茶概述..........................................................................................................11.1.1油茶的生态习性........................................................................................................11.1.2油茶的分布...............................................................................................................11.1.3油茶的经济和生态价值..........................................................................................11.1.4油茶的在生产中存在的问题..................................................................................21.2油茶炭疽病概述..............................................................................................31.2.1炭疽病发生的原因...................................................................................................31.2.2炭疽病的症状...........................................................................................................41.2.3炭疽病的防治方法..................................................................................................41.3油茶抗炭疽病机制研究进展..........................................................................52引言..........................................................................................................................72.1本研究目的与意义..........................................................................................72.2研究内容..........................................................................................................73材料与方法................................................................................................................93.1材料..................................................................................................................93.1.1供试材料...................................................................................................................93.1.2试验地概况...............................................................................................................93.1.3试验仪器...................................................................................................................93.1.4试验药品...................................................................................................................93.2测定方法..........................................................................................................93.2.1果实炭疽病发病率的测定......................................................................................93.2.2果实形态的测定....................................................................................................93.2.3果皮解剖结构的测定..............................................................................................93.2.4油茶果皮生理生化指标的测定............................................................................103.3数据处理........................................................................................................114结果与分析..............................................................................................................124.1果实形态学性状与炭疽病的关系.................................................................124.1.1果实颜色分类和形状的划分.................................................................................124.1.1.1果皮颜色的分类.................................................................................................124.1.2果实颜色和形状与炭疽病的关系.........................................................................124.1.3不同抗感类型的果实形态的差异分析................................................................134.2果实解剖结构与炭疽病的关系....................................................................164.2.1不同抗感炭疽病类型的油茶果皮解剖结构的比较............................................164.2.2不同抗感炭疽病类型的油茶果皮气孔参数的比较............................................174.2.3不同抗感炭疽病类型的油茶果实表皮毛性状的比较........................................184.3果皮生理生化特性与炭疽病的关系............................................................184.3.1果皮pH值..............................................................................................................184.3.2果皮相对电导率....................................................................................................194.3.3果皮单宁含量.........................................................................................................19V 4.3.4果皮花青色含量....................................................................................................204.3.5果皮可溶性糖含量................................................................................................214.3.6果皮PAL活性.......................................................................................................214.4果实的形态学性状与炭疽病的相关及通径分析........................................224.4.1果实的形态学性状与炭疽病的相关分析............................................................224.4.3果皮生理生化指标与炭疽病相关分析................................................................234.4.4果皮生理生化指标与炭疽病的通径分析............................................................245结论与讨论..............................................................................................................265.1结论................................................................................................................265.2讨论................................................................................................................275.2.1果实植物学形态与炭疽病的关系........................................................................275.2.2果实解剖结构与炭疽病的关系............................................................................275.2.3果皮生理生化特性与炭疽病的关系....................................................................28作者简介......................................................................................................................36参加的科研项目..........................................................................................................36在读期间发表的学术论文及科研成果......................................................................36VI 1文献综述1.1油茶概述1.1.1油茶的生态习性油茶（Camelliaoleifera）是一种山茶科山茶属的树种，其原产于我国，是我国南方特有的经济林木，广义的油茶是指山茶属中种子含油率较高、并且具有一定栽培经营面积的树种的总称[1-2]。油茶是常绿小乔木，矮的2m-3m，高的达到3m-6m，树皮灰褐色且光滑，单叶互生、革质、光滑、柄短，先端尖，边缘有锯齿，侧脉不明显。两性花，白色，没有柄，每年的10月中下旬开花，直到次年的10月份左右果实才能成熟[3]。果实为蒴果，形状为椭圆形、圆形和卵形等。种子褐色具有光泽，卵形或三角形。油茶喜温暖湿润的气候，要求年均温度为14℃-21℃，最低月均温度最好不低于0℃，短时间的绝对低温（-10℃）可以过冬，最高月平均温度为31℃，相对湿度为74%-85%，年均降雨量在1000mm以上，并且四季分配均匀，日照在1800h-2200h。但是在我国甘肃、陕西、河南等地发展油茶地区，年降雨量不到1000mm，并且干燥寒冷，也能生长。油茶对土壤的要求不高，pH值在4.5-6.5适宜，在pH值5-6的酸性红壤和黄壤最为适宜，适应性较强[4]。油茶对地势坡向有很大的反应，南坡阳光充足，有利于油茶光合作用，一向产量很高，最好是15°左右的缓坡，不适宜超过30°。一般情况下，在南坡海拔800m和北坡海拔500m以下地势开阔地区，油茶生长结实良好，油茶树是一种萌芽力很强的树种，其主根可以深入土壤2m-3m以上，一般栽培的油茶根浅的根仅有50cm-70cm，深的可达到100cm-150cm以上[5-6]。1.1.2油茶的分布油茶主要产于我国南方，主要分布在我国长江流域以南的地区，湖南、福建、广东、浙江、安徽、台湾等地。其中江西、广西、湖南三省油茶的面积占到全国总面积70％以上[7]。南北分布在北纬18°21′-34°34′，以河南的罗山，江苏的云台山等县，湖北的竹山等县，安徽的六安县为北界，东西分布在东经98°40′-121°40′，东起浙江的镇海、福建的福安等县。西抵云南和四川部分地区。垂直分布多在在海拔800mm左右，特别是在海拔500m以下的丘陵山地。但是在安徽黄山海拔900m处，油茶也能生长。除此之外，越南、泰国、日本、缅甸和马来西亚等国也有少量栽培[8-9]。1.1.3油茶的经济和生态价值油茶是常绿阔叶树种，属于深根性树种，对土壤要求不高，耐干旱、瘠薄，1 且寿命长，适应性很强，不仅具有很高的经济价值，生态功能也十分突出如水土保持、防火等方面也具有重要的作用[10]。其茶油中主要以油酸和亚油酸为主，其不饱和脂肪酸达到90%以上，还含有较多的维生素E、维生素A等，具有降低血脂、肝脂、减轻血小板聚集力的作用，并且对预防冠心病等有良好的作用，有利于人的身体健康，尤其针对中老年人的健康问题，也是作为我国有效缓解食用油供应紧张的重要油料树种，于是掀起了一股前所未有的油茶热[11]。1.1.4油茶的在生产中存在的问题目前，我国栽培油茶已有2000多年的历史。据相关的部门统计，在我国其栽培面积6000万亩左右，年产茶油总量超过50万吨以上，可作为我国解决食用油危机的重要树种，其又具有适应性强，适用领域广、较高的经济价值等优点，其开发利用的潜力巨大，并且在慢慢被挖掘，其茶油的消费市场也在逐年不断地扩大，因此，油茶在我国国民经济建设和发展中发挥了非常重要作用[12]。近年来，伴随着人民生活水平的提高，油茶的许多种优点逐渐被人们所认识，更多的学者将焦点放在油茶各方面的研究与探讨，研究范围和深入程度也是在不断上升[13]。在国家层面上，油茶也受到了国家政府和相关部门前所未有的重视，并且出台了相关政策，如2009年，国家林业局颁布了油茶产业发展规划，计划于2011-2015年5年内，油茶造林面积实现3250.23亩（其中新造油茶林834.50万亩、低产林改造2415.73万亩）；2016-2020年的5年内，造林2452.12万亩（其中新造林1539.50万亩，低产林改造912.62万亩）[14]。随着政策的大力支持和社会需求的增加，油茶产业迎来了前所未有的机遇以及广阔的空间供其发展。据相关调查显示，在油茶的生产中，油茶炭疽病（ColletotrichumgloeosporioidesPenz.）会造成花蕾、叶片、果实的脱落，甚至枝梢干枯，严重影响了油茶的产量和质量，是其主要的病害之一。温暖、湿润的气候条件为病害的发生、传播提供了更有利的条件，使炭疽病在油茶种植区严重发生[15]。因此，到了果实的采收季节，部分炭疽病发病严重的植株上，果实却所剩无几，甚至颗粒无收[16-17]。在油茶的生产中，炭疽病对油茶危害非常大，是影响油茶产量的最主要因素之一。油茶产业中重要工作之一是：炭疽病能够在油茶生长发育过程中，得到有效的控制，近年来，在炭疽病防控措施方面，主要以化学方法为主，但是，由于复杂的地形地势，导致油茶的这种防治途径很难得到应用和大面积的推广[18]。同时不同的油茶植株或不同的品种之间的特性差异明显，所以，使该病得以有效的控制的关键措施是选育抗病的优良品种。2 1.2油茶炭疽病概述1.2.1炭疽病发生的原因病害的发生是寄主植物、病原菌、环境条件这三者相互作用的结果，同时与人类活动密切相关[19]。（1）寄主植物在自然界中，油茶品种有很多，目前大面积栽培的是普通油茶，是抗病性较弱的品种，并且以纯林的形式集中栽培，为病原物的传播以及蔓延提供了充足的营养条件，又因为栽培的立地条件和管理不善等，更加有利于病害的发生与流行。同时，油茶在开花到结果需要经历近1年的时间，在其生长发育过程中的一种较少的现象，很可能是导致果实病害严重的原因。我国油茶分布于我国广大的亚热带地区，气候温暖、湿润，更为炭疽病的发生、传播提供了条件，导致种植区病害严重，直接影响油茶的产量和质量。因此，油茶炭疽病的防治在油茶的栽培和生产上是一个重大问题，应备受生产者关注[20-24]。（2）病原物病原属于真菌半知菌亚门中的胶胞炭疽菌（ColletotrichumgloeosporioidesPenz）。分生孢子梗聚集成盘状，其中混生数根茶褐色的刚毛[25]。油茶的很多部位均能被病原物所侵染（油茶的花器、叶片、果实、树枝等），病原物侵染时间长，并可同时并可辗转侵染；因为油茶为多年生的常绿树种，树体较低矮，病原物能在树体上顺利度过冬天，而且能快速积累。油茶林内的一些被病原菌感染的植株，也可作为病原物的传播来源。这样会导致做到清除病原物十分困难，同时，油茶的叶片存活时间较长、且一直繁茂，给树体上的病斑发现和清除带来了困难。（3）环境条件①病害与温度：果实病害在温度为15℃-19℃左右时发生，当温度达到24℃-30℃时病菌迅速扩展。但在自然界中，温度主要影响开始发病的时间，且每年的温度都能达到发病温度的基本要求，因此，温度对病害发生的影响较小，不是该病发生的关键因素。②病害与湿度：炭疽病菌的孢子传播和侵入都离不开较高的湿度，雨水或林内湿度是影响炭疽病病情发展的最主要环境因素。由于油茶的分布区域的气候条件，导致油茶林间湿度较大，灌丛状树木，导致密度较大，林间通风透光条件差，有利于炭疽病等病害的发生与传播。③病害与立地和林分：部分油茶栽植的立地条件相对较差：油茶林的立地坡度大并且其土壤贫瘠，因此，油茶生长势弱有助于加重病情。（4）人为因素3 在油茶种苗的运输过程中存在以下问题：长时间的异地运输，可使老种植区的病害流向新种植区；选择不适合的油茶品种、或与油茶间种或套种的植物选择不当、病虫害防控不及时等情况，都有加速病害的发生与蔓延；在进行除草和油茶果实采收等农事活动中，由于不当的人为操会导致油茶大量枝条受伤，甚至植株产生伤口，有利于炭疽病等病害的发生[26-27]。综上所述，油茶病害的发生、甚至扩散的基本条件是：油茶植物本身、病原物、环境条件和人为活动条件。因此，在油茶病害的防治过程中，我们一定要了解各种病害能够发生的条件，努力排除导致油茶植株发病的因素，最终能够减轻或阻止病害的发生[28]。1.2.2炭疽病的症状油茶的地上部位均可受到病原物的侵害，但主要以果实为主。当果实被病菌侵染初期，病斑呈小点、褐色，之后慢慢扩大为圆形，中央呈现灰褐色，边缘黑褐色，发病严重时果实的颜色全变黑色。当到达侵染的后期病斑变现凹陷，上面布有轮生的小黑点，这是病菌的分生孢子盘。当天气潮湿时，可产生粘稠状的淡粉红色分生孢子脓[27-28]。一个小黑点可在果实上产生1-10个以上病斑，病斑扩散可发展为片，如果病斑面积发展到果面面积的1/4以上时，往往会导致果实脱落，如果是即将成熟的果实，果实会从中间开裂。叶片上的病斑常发生在叶尖部和缘处，病斑初期中央为黑褐色，边缘紫红色，呈现半圆形。病斑后期的中部呈灰白色，上轮布有小黑点，呈现波纹状。嫩梢上的病斑则呈现舌状或长椭圆形，初期为黑褐色，后期变为黑色[29-30]。发病的树梢容易弯曲，当病斑的面积扩大到枝梢茎围的2/3以上时，梢会失水萎蔫、枯死。没有枯死的梢上会产生中间部分凹陷的病斑。1.2.3炭疽病的防治方法（1）选育抗病良种：在防治油茶炭疽病措施中，最有效的措施是选育抗病良种，适地推广抗病物种和类型，大力选择油茶物种中的优良植株。但是同时还需要在人工鉴定的前提下，保证抗病的稳定性。一般采用扦插或嫁接等无性繁殖方法，扩大繁殖选出的抗病良种，这样可避免油茶之间异花授粉，进而破坏优良单株抗病性的遗传[31-32]。（2）清除林间病源：发病严重的油茶植株，其果实所剩无几，不仅失去其经济价值，同时还会不断地积累和传播病菌，因此，在油茶的栽培管理中，应坚决清除林间病源。在每年油茶炭疽病发病稳定期，全面调查油茶病情，随时将发病严重的植株标记，并采取相应的措施：在冬季挖掉发病严重的油茶植株或者在次年对其进行嫁接，使其更换树冠，同时结合冬季和夏季的修剪，需要注意：在冬季修剪时，应剪除掉树上各发病部位。剪除发病部位以下5cm的病枝和枯枝，4 但遇到较大的溃疡斑，应用刀将病斑刮除，直到木质部无变色处为止，刀具和刮口要提前做好消毒工作（用75%的酒精或0.1%的升汞水），并在伤口涂波尔多浆来进行保护[33]。在夏初修剪时，剪掉不定芽萌条和徒长枝，还要注意将剪掉的发病部位最后要带至林外烧毁或进行深埋。（3）林分结构的调整：首先要保证油茶栽培的密度要合理。其原则是保持林分内油茶植株间枝叶不相衔接，即郁闭度小于0.7为好。林内避免种植高秆或半高秆作物，保证油茶林的通风及透光[34-35]。（4）在丰产油茶林中，药剂防治则是非常重要的防控措施之一。尤其是在所建立的油茶种子园里，为了最终能够获得无病的种子，更必须要进行药剂防治。但是油茶栽培的面积大，导致多次全面的喷药则不可能做到，喷药次数也受到限制，因此，选择合适的喷药时期更为重要。一般在春新梢生长时是炭疽病病菌的较易侵染的时期，此时是防治油茶的初次侵染的最佳时期，对油茶植株喷射1%波尔多液，起到保护的作用。在6月-9月果实发病盛期，每隔半月喷射一次1%波尔多液。此外，于冬前、次年4月下旬-5月中旬左右，用50%多菌灵或50%特布津500倍液，各喷油茶一次，能够有效地减少病菌能够越冬的数量，其中，在近期的试验研究的结果中发现，对油茶炭疽病的防治效果相对较好的药物是硅唑多菌灵等[36-37]。1.3油茶抗炭疽病机制研究进展林木抗病性是指树木对病原物抵抗和忍耐的能力，通过各种症状在受侵害的书树木上表现出来，是树木的能力的体现[38]。植物生存的自然界是一个复杂的体系，在其生长发育的各个阶段中，常常会受到各种病原菌的侵染，引起致病，如真菌、细菌和病毒等。在自然生态系统中病原微生物和植物长期并存，相互适应、选择，甚至协同进化，使抗病性与致病性之间达到动态平衡。在动态平衡的基础下，同时寄主植物的一部分代谢功能也会发生变化，并且在植物的形态上也会发生相应的变化，表现出不同的抗病类型。因此，对寄主植物的生理生化特性的研究，有利于阐明病原物的致病机理以及寄主植物的抗病原理，以及掌握寄主植物的抗病反应，从能提高这些生理生化物质来增加植物的抗病性，同时为育种等方面提供科学依据[39]。国内外研究表明，植物本身的形态结构与其抗病性的关系密切，仅表皮结构与抗病的关系方面，在哈密瓜[40]、苹果[41]和华山松[42]等多种植物上均有报道；有关气孔特性与抗病性的关系在作物中研究较多[43-45]，但林木中研究较少[46]；表皮毛特征与抗病性也有一些报道[47-48]。目前关于油茶果皮解剖结构与其抗炭疽病方面的研究还极少，只有肖元清等[49]研究发现，抗病优良单株的果实表皮层厚度和细胞结构排列的紧密程度明显高于感病类型。5 研究显示，油茶果实的颜色与炭疽病的抗性有一定的相关性，变现为：红果油茶抗性较强；青果类型抗性弱；杂色果病果率介于两者之间[21]。长期以来，油茶果皮的酶活性和内含物与发病率的关系一直受到研究者的广泛关注，曹志华等[50]研究发现，苯丙氨酸解氨酶的活性与酚类化合物的合成密切相关，其含量的增多可提高油茶的抗病性。还有研究发现，果皮内单宁和可溶性糖含量低的油茶品种表现为感病[5]。6 2引言2.1本研究目的与意义油茶炭疽病(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)是油茶的主要病害之一，造成花蕾、果实、叶片的大量脱落，甚至枝梢干枯，严重影响油茶的产量和质量。我国油茶主要分布在长江以南，温暖、湿润的气候条件为病害的发生、传播提供了有利条件，使其在油茶种植区发生普遍而严重[19]。因此，油茶炭疽病的防治是油茶生产上一个重要问题，备受生产者关注。但是在油茶炭疽病防治的方面，目前一般是采取化学措施，但化学防治所带来的负作用，比如农药的残留、环境的污染、降低其加工产品的品质，在茶油的消费市场上，这种防治措施很难被人们所接受[51]。研究和实践证明，利用植物自身的特性，培养出抗病、优质油茶新品种才是解决上述问题的重要措施之一。同时在调查中发现，油茶作为一种异花授粉植物，生长在同一环境、管理抚育措施相同条件下，林间不同果实类型的抗病性和产量之间存在着明显的差异，有些植株几乎不发病，但有些单株的发病率竟可达100%，这就为选育油茶抗病品种提供了丰富的资源。本研究以不同果实类型的油茶植株为试验对象，拟通过调查果实炭疽病发病率、测定其形态性状和生理生化特性，以期进一步了解油茶的抗病机制，找出与油茶抗炭疽病相关的物质特征，最终为控制油茶炭疽病的发生发展、提高油茶生产效益提供服务。同时也为油茶种质资源收集、选育优良品种提供理论依据，以实现丰产栽培，提高其经济效益。2.2研究内容(1)不同类型果实炭疽病发病率在9月下旬病害发生盛期，全面踏查没有任何防治的油茶试验林，记录不同的果实类型，并做标记，连续3年统计病果数，并计算其发病率。(2)果实形态通过测量和计算果实的大小、颜色、形状、面积等指标，分析不同抗病类型果实的形态特征上的差异。(3)果皮解剖结构对不同抗病类型果实的果皮进行解剖，测量果皮单位气孔数量、开度和大小；角质层、上表皮、薄壁组织和总厚度以及果皮表面茸毛的长度、密度等指标，分析不同发病率的果皮解剖结构的差异。(4)果皮生理生化指标测定不同炭疽病发病率的油茶果实的相对电导率、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、7 可溶性糖等含量，探讨炭疽病与果皮内含物之间的关系。8 3材料与方法3.1材料3.1.1供试材料试验材料均来源于安徽省德昌苗木有限公司，为油茶种植园中普通油茶品种的植株（见附图）。3.1.2试验地概况试验地位于安徽省舒城县，地处于大别山余脉，属于亚热带湿润季风气候区，年均气温为15.6℃，年日照时数为1969.2h，年均降雨量1100mm，试验地四周环山，常年湿度较大，是油茶炭疽病易发生区。3.1.3试验仪器电子天平、滤纸、小漏斗、离心机-AnkeTGL-16G、DHG-9070A型烘箱、、研钵大号培养皿、移液管、容量瓶、大号培养皿、剪刀、紫外分光光度计、电导仪、恒温水浴锅、自封袋、9HW-1恒温磁力搅拌器容量瓶、三角瓶(20、50mL)、小漏斗、移液管、滤纸、研钵、显微镜、恒温水浴锅等。3.1.4试验药品聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、石英砂、冰块、pH8.8硼酸缓冲液、靛红、0.01mol/L高锰酸钾标准溶液、0.1%靛红溶液、0.1mol/LNaOH、0.01mol/L高锰酸钾溶液、活性炭、蒽酮乙酸乙酯试剂、1%蔗糖标准液、100μg/L蔗糖标准液、浓硫酸乙醇、甲醇。3.2测定方法3.2.1果实炭疽病发病率的测定每个茶油的果实类型随机选择植株20株，做好标记，连续3年（2012-2014）在每株树冠外围中上部于东、西、南、北4个方向分别抽查果实25个，统计病果数，并计算其发病率（Y），重复3次。3.2.2果实形态的测定将每个果实类型的果皮擦干净，用游标卡尺测量所有果实的横纵直径，并计算果实大小。用天平称量每个单果的鲜重并记录不同油茶果实的形状颜色等。(果实横径+果实纵径)/23.2.3果皮解剖结构的测定（1）果皮解剖结构测定：取每个抗感类型的果实15个，分别在果实赤道部位取长5mm、宽3mm的材料，放入FAA固定液中固定24h。用体积分数为65％，75％，85％，95％，100％的乙醇逐级脱水。依次经二甲苯+乙醇、二甲苯处理，直至使果皮透明，石蜡切片法切片（切片厚度为10μｍ），番红－固绿对染，在9 OLYMPUS-BX41光学显微镜下观察并照相记录，显微测微尺测量果皮总厚度、蜡质层、角质层和薄壁组织厚度。所有观测值均为30个视野的平均值。（2）气孔参数采用水合氯醛法[52]测定，取样方法同（1）。气孔开度＝内纵径×内横径气孔大小＝外纵径×外横径２气孔密度＝气孔数量／视野面积＝气孔数量／1.65mm单位气孔面积＝气孔开度×π×0.25×气孔密度（3）表皮毛测量：表皮毛指标测量采用火棉胶法[52]，取样方法同（1）。２表皮毛密度＝表皮毛数量／视野面积＝表皮毛数量／1.65mm3.2.4油茶果皮生理生化指标的测定将采集的果实用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次，采用健康的果皮来测定生理生化特性。（1）叶片细胞膜质透性测定用电导法测定，于第三次喷施叶面肥后90d，选取相同部位油茶叶片剪下后，先用纱布擦拭干净，平均分为3份，每份精确称取1g。用蒸馏水冲洗2次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成1cm小段放入小玻璃杯中，加入25ml蒸馏水浸泡2h后，用电导仪测量每一小杯中溶液的电导度，再在100℃水浴锅中煮沸30min，冷却至室温后再次测定电导率值。（2）pH值的测定称取待测果皮1.2g剪碎，加入7mL蒸馏水研磨匀浆，TGL-16M台式高速冷冻离心机（6000r/min）离心15min，取上清夜。用PHS-25C型pH测试仪测定提取液的pH值。（3）苯丙氨酸解氨酶（PAL）的测定PAL活性的提取与活性测定采用欧阳光察[52]的方法（用紫外可见分光光度计测定OD−1·min−1）：先称取果皮5g，加290值变化0.01为1个酶活性单位，U·g0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、少许石英砂、适量冰块，研磨成匀浆。加入15mLpH8.8硼酸缓冲液，4℃，6000r／min离心10min，上清液为酶粗提取液。取1mL上清液，加4mL0.02mol／L苯丙氨酸溶液，加入5mLpH8.8硼酸缓冲液，40℃水浴30min，加入1mL6mol／LHCl终止反应。测定1min内290nm处吸光值变化，以吸光值变化0.001为1个酶活力单位U，酶活力表示为U／(min·g)。（4）花青素含量的测定为在520nm波长下测定果皮浸提液（1.00g果皮用刀片切成约1mm的厚度于磨口瓶中，加入pH等于3.0的25ml盐酸甲醇，放入水浴恒温振荡器中恒温10 30℃震荡18-24h，以果皮圆片变白色为准。）的吸光度值[53-54]，然后计算其含量；单宁含量的测定参考Terrill等[55]的方法；（5）可溶性总糖的测定采用蒽酮比色法[56]测定：称取剪碎的新鲜果皮0.5g左右，放入三角瓶(50mL)中，再加入25mL蒸馏水，石棉网上加热30min（加热过程中易沸腾，可用保鲜膜封口），取出冷却，过滤入50mL容量瓶中，用热水冲洗残渣数次，定容至刻度。精确吸取样品提取液0.5mL，蒸馏水1.5mL，蒽酮乙酸乙酯试剂0.5mL，浓硫酸5.0mL至大试管，充分振荡，沸水浴中保温1min，取出后自然冷却至室温，C×ＶＴ×Ｎ可溶性糖含量(%)＝×1006ＷＶ10×Ｓ×在分光光度计630nm波长处比色，以空白调零点，记录光密度值，各样品3次重复。在标准曲线上查出相应糖的微克值。按下列公式计算不同品种油茶果皮内可溶性总糖的百分含量：C-标准曲线查出的糖量（μg）；W-样品质量（g）；VT-提取液体总体积（mL）；VS-测定时所用样品提取液体积（mL）；N-稀释倍数以上每个指标，均重复3次，结果取平均值。3.3数据处理采用MicrosoftExcel2003、DPSV7.05和SPSS16.0软件进行数据处理分析和图表制作。其中，果形和果色采用赋值法[57]按球形、桔形、橄榄形、卵形顺序依次赋自然数1、2、3、4量化，栗红、纯青、青红、青黄、麻青赋自然数1、2、3、4、5量化，进行相关及通径分析和用单因素方差结合Duncan’s新复极差法对组间差异进行分析。11 4结果与分析4.1果实形态学性状与炭疽病的关系4.1.1果实颜色分类和形状的划分4.1.1.1果皮颜色的分类全面踏查试验林，对果实进行拍照和采样，根据对比原则和目测效果，首先确定每种颜色的范围，然后按照陈永忠主编的《油茶优良种质资源》[58]中关于果实的照片和颜色的描述，进行分类，在描述果实颜色时，对于混合色，采取先描述次色，再描述主色。并采用分级法，对果实目测红色的着色程度分为：全栗红色；青红相间，根据青色的着色程度分为：全青色；大面积青色；小面积青色。主要分为纯青、青黄和麻青色。4.1.1.2果实形状的分类典型的选取了油茶植株50株，采集每样株树冠外围中上部且未感病的果实30个，重复3次，参照彭邵峰[59]对油茶果形分类的方法，用分辨率为0.01mm的电子数显游标卡尺测量所采样本的果实的果高和果径，并计算果形指数（果高/果径）得出：X（平均果形指数）=1.08，s（标准差）=0.19，X+s=1.27，X-s=0.89，因此将所采样本分为4类，见表4-1。表4-1果实形状的划分Table4-1Theclassificationoffruitshape果形指数范围果形RangeoftheshapeindexoffruitFruittype≥1.27橄榄形Olive-shaped1.08-1.26卵形Oval0.89-1.08球形Spherical＜0.89桔形Orange-shaped油茶果实主要分为橄榄形、卵形、球形和桔形，其果形指数分别为：≥1.27、1.08-1.26、0.89-1.08和＜0.89。4.1.2果实颜色和形状与炭疽病的关系根据颜色和形状的结果，选取典型的油茶植株做标记，并对其3年果实炭疽病调查的结果如下：可以看出不同类型果实炭疽病在连续3年内发病率波动较小，其中纯青球和栗红球连续3年的均是0%，属于高抗品种，青黄球的发病率为11.7%，属于中抗类型，青黄球是中感类型，青黄卵的发病率高到75.8%，属于高感类型，但其中，球形既有抗病类型，又有抗病类型，青黄色的果实均属于12 感病类型，从表中还可以看出，抗病性较强的油茶果实果皮较抗性弱的光滑，因此，从颜色和形状相结合的角度来分析果实炭疽病发病率比单独分析颜色和形状与炭疽病的关系更加合理。表4-2不同油茶果实炭疽病的自然发病率表和抗感类型Table4-2Table1Naturalincidenceandresistantandsusceptibletypeofthetestedmaterials果实自然发病率%Naturalincidenceoffruits抗感类型材料名称果面光滑度平均值ResistantandMaterialname201220132014SurfaceAveragevaluesusceptibletypesmoothness纯青球光滑0.00.00.00.0PurecyansphereSmoothness高抗(HR)栗红球光滑HighlyresistanceChestnutred0.00.00.00.0Smoothnesssphere青红球光滑中抗(MR)12.614.011.511.7GreenredsphereSmoothnessMiddleresistance青黄球中感(MS)糠皮Greenyellow50.047.449.649.0MiddleMattespheresusceptible青黄卵糠皮高感(HS)77.270.280.075.8GreenyellowovalMatteHighlysusceptible材料名称根据彭邵锋等[59]对油茶果色、形状的分类来命名；抗病类型参考杨光道等[60]关于油茶果实抗炭疽病的分级标准。4.1.3不同抗感类型的果实形态的差异分析4.1.3.1果实横径由图4-1可知，不同抗感类型的果实横径范围为2.58cm-3.53cm，组间差异明显，且果实的横径随着果实抗病的减弱呈减小的趋势，高抗类型果实的横径最大，达到3.53cm，高感类型的果实横径最小，仅仅为2.58cm，与高抗类型相比，中抗、中感和高感类型的果实横径分别减少7.00%、13.03%和26.91%。图4-1不同抗感炭疽病的果实横径比较Fig.4-1Comparisononthetransversediameterofdifferentresistantandsusceptiblefruit经方差分析和多重比较可知，不同抗病类型果实的横径大小的差异达到了极13 显著水平（p＜0.01），且抗病的高抗和中抗类型的果实横径均极显著高于感病的中感和高感类型的果实横径，高抗类型的果实横径显著高于中抗类型，中感类型果实横径显著高于高感类型果实的果实横径。4.1.3.2果实纵径不同抗感炭疽病果实纵径的变化趋势与果实横径的变化趋势相类似，高抗类型＞中抗类型＞中感类型＞高感类型，依次为：3.56cm、3.20cm、3.11cm和2.97cm。图4-2不同抗感炭疽病的果实纵径比较Fig.4-2Comparisononthelongitudinaldiameterofdifferentresistantandsusceptiblefruit经方差分析和多重比较可知，不同抗感炭疽病的果实纵径间的差异不明显，没达到显著水平（见图4-2）。由此可知，果实的纵径与炭疽病发病率之间的关系并不紧密，不能作为衡量油茶果实炭疽病抗性的指标之一。4.1.3.3果实大小由图4-3结果可知，不同抗感类型果实大小的范围为4.26cm-5.32cm，表现出，随着感病程度的增加，果实大小呈现减少的趋势，各类型果实大小为，高抗类型＞中抗类型＞中感类型＞高感类型。高抗类型的果实的大小比中抗、中感、高感类型分别增大了10.31%、18.36%和29.02%。图4-3不同抗感炭疽病的果实大小比较Fig.4-3Comparisononthefruitsizeofdifferentresistantandsusceptiblefruit由方差分析结果可知，不同抗感炭疽病果实大小的差异达到极显著水平。多14 重比较结果显示，高感类型的果实大小极显著小于其他3个类型；高抗类型的果实大小显著大于中抗类型；中抗类型的果实大小显著大于中感类型；中感类型的果实大小显著大于高感类型；高抗、中抗和中感类类型的果实大小虽有差异，但没达到极显著水平。4.1.3.4单果鲜重由图4-4可见，不同抗病类型的果实鲜重量差异明显，高抗类型果实的鲜重最大，达到22.82g，高感类型的果实鲜重量最小，仅仅为14.07g，与高抗类型的果实重量相比，中抗、中感和高感类型的果实鲜重分别减少了12.58%、26.70%和38.29%。图4-4不同抗感炭疽病的果实鲜重比较Fig.4-4Comparisononthefruitweightofdifferentresistantandsusceptiblefruit由方差分析和多重比较结果可见，不同抗感炭疽病的果实大小差异达到显著水平。高感类型的果实鲜重显著小于其他3个类型；中感类型的果实鲜重显著小于中抗和高抗类型，中抗类型的果实鲜重显著小于高抗类型。4.1.3.5果实面积由图4-5可以看出，不同抗感类型果实的面积，随着感病程度的增加而呈现减少的趋势，各类型果实大小顺序为，高抗类型＞中抗类型＞中感类型＞高感类型，大小为10.39cm2、8.99cm2、8.09cm2和7.04cm2。高抗类型果实的面积比其他类型大13.47%、22.13%、和32.24%。15 图4-5不同抗感炭疽病的果实面积比较Fig.4-5Comparisononthefruitareaofdifferentresistantandsusceptible由方差分析和多重比较结果可见，不同抗感炭疽病的果实鲜重差异达到显著水平。感病类型的果实鲜重显著小于抗病类型，其中，中抗和高抗类型、中感和高感类型之间的果实鲜重差异不显著。4.2果实解剖结构与炭疽病的关系4.2.1不同抗感炭疽病类型的油茶果皮解剖结构的比较由表4-3可见，油茶不同抗病类型果实的果皮总厚度，蜡质层、角质层和薄壁组织厚度有明显差异，各指标由大到小的排序均表现为高抗（两个高抗类型的均值）>中抗>中感>高感，其中高抗果实类型的上述指标分别为5.33×103μm、35.68μm、25.85μm和87.73μm；高感类型分别为2.77×103μm、19.33μm、9.67μm和48.33μm，两者相比，高感类型较高抗类型的降幅分别达到48.03%、45.82%、62.59%和44.91%。表4-3不同抗病类型的果皮解剖结构参数Table4-3PeelanatomystructureparameterunderdifferentresistanttypesofC.oleiferafruits果皮结构参数/μmStructureparameterofpeel材料名称角质层厚度薄壁组织厚度果皮总厚度蜡质层厚度MaterialnameThicknessoflaminaThicknessofThicknessofpeelThicknessofwaxcorneumparenchyma高抗(纯青球)5.46×103±75.98aA35.33±1.17aA25.61±0.37aA91.83±3.14aHighlyresistance高抗(栗红球)5.19×103±55.08aA36.01±1.07aA26.08±0.57aA83.63±1.54aHighlyresistance中抗(青红球)4.29×103±62.17bB29.90±0.85bA20.78±0.86bAB70.08±1.07abMiddleresistance中感(青黄球)Middle3.38×103±37.17cC23.83±1.25cB15.07±1.34cBC67.66±3.32absusceptible高感(青黄卵)Highly2.77×103±89.65dC19.33±0.76dB9.67±1.18dC48.33±2.37bsusceptible注：不同大小写字母分别代表处理间均值在0.01和0.05水平存在显著性差异，下同。Note:Differentcapitalandlowercaselettersinthisandfollowingsheetsdenotestatisticaldifferencesamongtreatmentsat0.01and0.05levelsrespectively.Thesameasbelow.16 经方差分析可知，不同抗病类型间果皮总厚度、蜡质层和角质层厚度差异均达到极显著水平（P=0.0012、0.0001、0.0003），薄壁组织厚度达到显著水平（P=0.0299）。多重比较结果显示，高抗类型果皮总厚度极显著大于中抗、中感和高感3个类型，其角质层厚度极显著大于感病类型（中感、高感），抗病类型（中抗、高抗）的蜡质层厚度极显著大于感病类型；在果皮薄壁组织厚度方面，高抗、中抗和中感的果皮薄壁组织差异不显著，中抗、中感和高感间差异也不显著，仅高抗品种与高感品种差异达到显著水平，这表明果皮蜡质层和角质层对炭疽病菌的防御作用较薄壁组织更为明显，且2个高抗类型果实上述各项指标差异微小，说明高抗品种具有相似的果皮结构厚度。4.2.2不同抗感炭疽病类型的油茶果皮气孔参数的比较从表4-4可以看出，不同抗感炭疽病油茶果皮的气孔参数规律明显，果实由高抗到高感类型，气孔开度、密度和单位气孔面积的值均呈现增大的趋势，以高感类型为最大，分别达到38.58μm2、22.02个•mm-2和670.50μm2；高抗类型最小，分别为12.59μm2、5.05个•mm-2和82.21μm2；而中感和中抗类型介于两者之间。气孔大小与抗病性关系不明显，最高的为中感类型1579.46μm2•mm-2，最低的中抗为1461.03μm2•mm-2。表4-4不同抗病油茶果实类型的气孔参数比较Table4StomaparameterunderdifferentresistanttypesofC.oleiferafruits果皮气孔参数Stomaparameterofpeel材料名称气孔密度单位气孔面积气孔大小/μm2气孔开度/μm2Materialname/(个•mm-2)/(μm2•mm-2)StomasizeStomaapertureStomadensityUnitareaofstoma高抗(纯青球)1489.62±120.4013.03±1.03aA5.25±0.34aA56.56±6.13cCHighlyresistance高抗(栗红球)1513.02±62.7012.15±2.09aA4.85±1.05aA107.86±6.13cBCHighlyresistance中抗(青红球)1461.03±81.0319.17±3.88bAB9.09±0.60bB137.60±34.85cBCMiddleresistance中感(青黄球)Middle1579.46±183.7924.91±5.18cBC13.93±1.60cC323.23±22.17bBsusceptible高感(青黄卵)Highly1199.02±73.2738.58±6.41dC22.02±2.86dC670.50±160.23aAsusceptible方差分析结果显示，不同抗病类型果皮气孔开度、密度和单位气孔面积的差异均达到极显著水平（P=0.0003、0.0001、0.0016），气孔大小的差异没有到达显著水平（P=0.8681）。由多重比较结果可知，高抗类型果皮的气孔密度都极显著小于中抗、中感和高抗3个类型，中抗类型极显著小于感病类型；同时高抗类型17 果皮气孔开度和气孔单位面积极显著小于感病类型，由此可见，气孔密度、气孔开度、单位气孔面积是抗病类型区别于感病类型的重要特征。4.2.3不同抗感炭疽病类型的油茶果实表皮毛性状的比较不同抗感炭疽病类型果实的表皮毛长度和密度的差异明显，由高到低依次均为高抗＞中抗＞中感＞高感。高抗类型的表皮毛长度相较于中抗、中感和高感分别增加了96.38μm、207.55μm和294.55μm，表皮毛粗度分别增加了10.36μm、17.61μm和29.21μm，表皮毛密度分别增长了2.59根•mm-2、5.62根•mm-2和8.65根•mm-2（见表4-5）。表4-5不同抗病油茶类型果实表皮毛性状Table4-5EpidermalhairsparameterunderdifferentresistanttypesofC.oleiferafruits果皮表皮毛结构参数Epidermalhairsparameterofpeel材料名称表皮毛粗度/μm表皮毛长度/μm表皮毛密度/(根•mm-2)MaterialnameEpidermalhairsEpidermalhairslengthEpidermalhairsdensityroughness高抗(纯青球)710.50±9.00aA50.75±0.82a11.31±0.69aAHighlyresistance高抗(栗红球)719.60±9.67aAB52.14±0.62a10.42±0.47aAHighlyresistance中抗(青红球)618.67±33.48bC41.08±0.64a8.28±0.53bABMiddleresistance中感(青黄球)Middle507.50±14.50cD33.83±0.95ab5.25±0.88cBCsusceptible高感(青黄卵)Highly420.50±13.67dD22.23±0.68b2.22±0.40dCsusceptible方差分析结果表明，不同抗感炭疽病类型果实的表皮毛长度和密度差异达到了极显著水平（P=0.0231、0.0002），其粗度差异没有达到显著水平（P=0.0684）。由多重比较结果可知，高抗类型果实表皮毛长度和密度极显著大于中抗、中感和高感3个类型；表皮毛粗度方面，高抗类型显著大于高感类型，而其余类型之间的表皮毛粗度差异均未达到显著水平；高抗的两种果实类型上述各指标差异均微小。4.3果皮生理生化特性与炭疽病的关系4.3.1果皮pH值油茶不同抗病类型的果实果皮pH值的测量结果如图4-6，果皮的pH值随着果实抗病性的增强，表现出缓慢增加的趋势，且其大小范围为4.01%-4.94%，高感类型的果皮pH值最高，其次为中感和中抗类型，最低的是高感类型的果皮pH值最高。18 图4-6不同抗感炭疽病的果皮pH值比较Fig.4-6ComparisononthepHvalueofdifferentresistantandsusceptiblefruit进一步方差分析和多重比较发现，不同抗病类型的果皮之间pH值的差异达到极显著水平（p＜0.01）。感病类型的果皮pH值极显著大于抗病类型，而中抗类型和高抗类型、中感类型和高感类型果皮的pH值之间的差异不显著。4.3.2果皮相对电导率由图4-7可知，不同抗病类型果皮相对电导率值得变化趋势与果皮pH值的变化趋势相似，由高到低的顺序为，高感类型＞中感类型＞中抗类型＞高抗类型，分别达到了36%、32%、29%和26%。图4-7不同抗感炭疽病的果皮相对电导率比较Fig.4-7Comparisonontheconductivityofdifferentresistantandsusceptiblefruittype统计分析结果表明，不同抗病类型的果皮之间相对电导率的差异达到极显著水平（p＜0.01）。高抗显著高于中抗和中感类型，极显著高于高感类型，中抗类型显著高于中感和高感类型，中感显著高于高感类型，而中抗、中感和高感类型之间差异没有达到极显著水平。4.3.3果皮单宁含量从图4-8可以看出，不同抗病类型的果皮单宁含量差异明显，其含量的范围为1.66%-4.16%，其中高抗果皮单宁含量最高，其次为中抗类型、中感类型和高感类型，依次比高抗类型的含量减少14.66%、45.19%和60.10%。19 图4-8不同抗感炭疽病的果皮单宁含量比较Fig.4-8Comparisononthetannincontentofdifferentresistantandsusceptiblefruit方差分析和多重比较结果表明，高抗类型的果皮对电导率显著高于中抗类型，极显著高于中感和高感类型；中抗类型的果皮对电导率极显著高于中感和高感类型；中感类型显著高于高感类型。由此可知，果皮单宁含量是衡量果实抗病性程度的重要指标之一。4.3.4果皮花青色含量从图中可以看出，果皮花青素含量从高到低依次为高抗类型、中抗类型、中感类型和高感类型，为22.75mg/g、20.14mg/g、18.94mg/g和16.74mg/g。中抗、中感和高感类型的果皮花青素含量较高抗类型分别减少11.47%、16.75%和26.42%（详见图4-9）。图4-9不同抗感炭疽病的果皮花青素含量比较Fig.4-9Comparisonontheanthocyanincontentofdifferentresistantandsusceptiblefruit进一步的方差分析和多重比较结果表明，不同抗病类型的果皮之间花青素含量的差异达到极显著水平（p＜0.01）。高抗类型果皮花青素含量极显著高于中抗类型、中感和高感类型；中抗类型果皮花青素含量极显著高于中感和高感类型；中感类型极显著高于高感类型。20 4.3.5果皮可溶性糖含量从图4-10可以看出，不同抗感炭疽病油茶果皮的可溶性糖含量规律明显，果实由高抗到高感类型，果皮可溶性糖的含量均呈现降低的趋势，以高抗类型为最大，分别达到2.37%、2.06%、1.78%和1.53%。图4-10不同抗感炭疽病的果皮可溶性糖含量比较Fig.4-10Comparisononthesolublesugarcontentofdifferentresistantandsusceptiblefruit统计分析表明，不同抗感炭疽病油茶果皮的可溶性糖含量差异达到显著水平（p＜0.01），高感果皮的可溶性糖含量显著低于中感、中抗和高抗类型；中感显著低于中抗和高抗；中抗显著低于高抗类型。4.3.6果皮PAL活性测量结果如图4-11，果皮的PAL活性值随着果实抗病性的增强，表现出增加的趋势，且其活性大小范围为28.67U•g−1•min−1-48.33U•g−1•min−1，高抗类型最高，其次为中抗类型，最低的是高感类型，较高抗类型果皮可溶性糖的含量分别减少了13.78%、24.13%、40.68%。图4-11不同抗感炭疽病的PAL活性比较Fig.4-11ComparisononthePALactivityofdifferentresistantandsusceptiblefruit方差分析结果表明，不同抗病类型果皮的PAL活性差异达到极显著水平（p＜0.01）。多重比较表明，高抗类型极显著高于中抗、中感和高感类型；中抗类型极显著高于中感和高感类型；中感极显著高于高感类型。21 4.4果实的形态学性状与炭疽病的相关及通径分析4.4.1果实的形态学性状与炭疽病的相关分析如表4-6，炭疽病的发病率与果实主要的形态学性状之间的相关分析结果表明，果实形态学性状与炭疽病之间具有很高的相关性。发病率与果实形状、颜色呈正相关，相关系数分别为0.7626和0.7335，与果实大小、横径、纵径、重量和面积呈负相关（R=-0.6451、-0.6335、-0.6335、-0.1684和-0.5343），其中，发病率与形状和果实面积相关性较弱，果色与发病率呈显著正相关，相关系数为0.7626。说明果色和大小与发病率联系较密切，按照纯青（栗红）、青红、青黄、麻青色果实发病率依次显著升高，果实越大，发病率有降低的趋势。因此在油茶抗病育种中,可以着重考虑选择果实颜色、大小、形状和鲜重等指标的特征，开展育种工作。表4-6不同果实形态学性状性状与炭疽病的相关分析Table4-6CorrelationanalysisamongmorphologycharacteristicsoffruitsofdifferentC.oleifera横径纵径相关系数形状颜色鲜重面积TransverseLongitudinalYCorrelationcoefficientShapeColourWeightAreadiameterdiameter大小Size-0.5680-0.6872*0.9384**0.9316**0.9346**0.6308*-0.6451*形状Shape0.31190.8346**0.9461**0.31890.8316*0.7335*颜色Colour0.02450.08450.02950.02450.7626*横径0.23150.23420.6335*-0.6335*Transversediameter纵径0.33410.6335*-0.6335Longitudinaldiameter鲜重Weight0.7335*-0.1684面积Area-0.5343*说明：*代表达到0.05水平显著性，**代表达到0.01水平显著性。(下同)。Note：*meanssignificantatthe0.05levelsand**meanssignificantatthe0.01levels.(Thesameasbelow.)4.4.2果实形态学性状与炭疽病的通径分析从表4-7可以发现，果实大小和形状对发病率的直接作用为效应，直接通径系数分别为-0.4914、-0.1161和-0.3312，果色对发病率的直接通径系数为0.5311。依据直接通径系数计算决定系数（直接通径系数的平方）得出，各性状对发病率的作用效应依次为果色(0.2821)＞大小(0.2415)＞形状(0.1097)＞横径（0.010）＞面积(0.0703)＞鲜重(0.0467)＞纵径(0.0135)。果色的决定值最大，其通过大小、形状、横径、纵径、鲜重和面积的间接通径系数分别为0.3377、-0.1033、-0.1033、-0.1281、-0.0161、-0.0308、和-0.1028，说明果色的直接作用也是超过其他因素的，尽管形状和面积能够降低它的直接作用，但是降低的效应小，说明果色对发病率的贡献值是由直接效应提供，在研究与炭疽病的关系中可作为首选形态学性状。22 表4-7果实形态学性状与发病率的直接和间接作用Table4-7PathcoefficientanalysisonmorphologycharacteristicsanddiseaseincidenceoffruitsofC.oleifera纵径直接系数横径因子大小形状颜色Longitud鲜重面积DirectTransverseFactorSizeShapeColour-inalWeightAreacoefficientsdiameterdiameter大小-0.49140.1881-0.06490.0231-0.36490.02310.0231Size形状-0.33120.27910.16560.05480.16560.05480.0548Shape颜色0.53110.3377-0.1033-0.1281-0.0161-0.0308-0.1028Colour横径Transverse-0.31610.09780.15640.0130.31440.31610.3161diameter纵径Longitudinal-0.11610.12110.13820.07540.18620.32160.2714diameter鲜重-0.21610.51250.16110.00610.21610.21110.2133Weight面积-0.26510.20010.01610.08610.0911-0.08160.3121Area4.4.3果皮生理生化指标与炭疽病相关分析表4-8相关分析结果表明：发病率与相对电导率呈极显著正相关(R=0.8370)，与pH值呈显著正相关(R=0.7065)，与花青素含量和PAL活性呈极显著负相关(相关系数分别为-0.8202和-0.8251)，与单宁含量和可溶性糖含量相关性较弱，相关系数分别为-0.1468和-0.3223。因此，在油茶抗病选育中，可依据果皮具有较小的相对电导率值和pH值，较高的花青素含量和PAL活性以初步筛选抗病品系。23 表4-8果皮生理生化指标与炭疽病的相关分析Table4-8CorrelationanalysisbetweenphysiologicalandbiochemicalindexesandthediseaseincidenceofC.oleifera相关系数花青素含量单宁含量可溶性总糖相对电导率PAL活性CorrelationAnthocyaninTanninSolubleYConductivityPALactivitycoefficientcontentcontentsugarcontentpH值0.8990**-0.1944-0.7427*-0.5113-0.7640*0.7065*pHvalue相对电导率-0.1890-0.7620*-0.5177-0.7165*0.8370**ConductivityPAL活性0.36470.05290.1773*-0.8251**PALactivity花青素含量Anthocyanin0.20240.7837*-0.8202**content单宁含量0.5159-0.3223Tannincontent可溶性总糖Solublesugar-1468content4.4.4果皮生理生化指标与炭疽病的通径分析为了进一步明确果皮各生理生化特性对发病率的作用大小和途径，进行生理生化指标与发病率的通径分析。表4-9果皮生理生化指标与发病率的直接和间接作用Table4-9PathcoefficientanalysisonphysiologicalandbiochemicalindexesandthediseaseincidenceoffruitscoatofC.oleifera可溶性花青素单宁直接系数PAL活性总糖因子pH值相对电导率含量含量DirectPALSolubleFactorpHvalueConductivityAnthocyaninTannincoefficientsactivitysugarcontentcontentcontentpH值0.60580.8868-0.01020.0567-0.11500.4940pHvalue相对电导率0.6864-0.5446-0.00990.0582-0.11640.4633ConductivityPAL活性-0.52500.1177-0.1864-0.02790.0119-0.1146PALactivity花青素含量Anthocyanin-0.37640.4500-0.75160.01910.0455-0.5067content单宁含量-0.22480.3097-0.51060.0028-0.0155-0.3336Tannincontent可溶性总糖Solublesugar-0.24660.4628-0.70680.0093-0.05990.1160content24 结果表明（表4-9）：各生理生化特性以相对电导率对发病率的正效应最大（0.6864），其次为pH值，通径系数为0.6058，通过其他特性的间接通径系数均较小，说明相对电导率和pH值对发病率的贡献主要由直接效应提供；单宁含量、花青素含量和PAL活性的直接作用均为负值(-0.2248、-0.3764和-0.2466)，且花青素含量通过pH值和相对电导率的间接通径系数较大，分别达到0.4500和-0.7516，对发病率的贡献主要是由间接作用提供；单宁含量通过其它特性的间接通径系数均较小，说明单宁对发病率的贡献主要是由直接作用提供。计算各指标对发病率的决定系数得出：相对电导率(0.4711)＞pH值(0.3670)＞PAL活性(0.2756)＞花青素含量(0.1417)＞可溶性糖含量(0.0608)＞单宁含量(0.0505)。25 5结论与讨论5.1结论本研究以“普通油茶”植株为试验材料，拟通过调查果实炭疽病发病率、测定其形态和解剖特征和生理生化特性，找出决定抗性差异的特征，以期进一步了解油茶的抗病机制，并为选育抗病良种提供理论依据。主要结果如下：（1）经过试验调查和归纳总结得出，油茶果实主要颜色有纯青色、栗红色、青红色、青黄色和麻青色。分别占样果的7.9%、14.8%、30.6%、42.1%和4.6%，可见果色主要以混合色为主。经过计算果实的形状指数，将果实的形状主要划分为球形、卵形、橄榄形和桔形，分别占样果的29.0%、34.0%、17.0%和20.0%。（2）通过颜色和形状将果实分为不同的类型，调查连续3年的炭疽病发病率，选取典型的类型进行形态学性状分析，其中纯青球和栗红球属于高抗品种，青红球属于中抗类型，青黄球是中感类型，青黄卵的发病率高到75.8%，属于高感类型，但其中，球形既有抗病类型，又有抗病类型，青黄色的果实均属于感病类型，从果实表面还可以看出，抗病性较强的油茶果实果皮一般较抗性弱的光滑。（3）不同抗感类型的果实形态的差异分析结果显示，不同抗感类型的果实横径范围在2.58cm-3.53cm，差异达到极显著水平，且果实的横径随着果实抗病的减弱呈减小的趋势，果实的纵径的变化趋势与横径相类似，经方差分析和多重比较可知，不同抗感炭疽病的果实纵径间的差异没达到显著水平。果实的大小、鲜重和果实面积均是随着感病程度的增加呈现减小的趋势，不同类型间差异均达到显著水平。（4）油茶不同抗病类型果实的果皮总厚度，蜡质层、角质层和薄壁组织厚度有明显差异，各指标由大到小的排序均表现为高抗类型>中抗类型>中感类型>高感类型；不同抗感炭疽病油茶果皮的气孔参数规律明显，果实由高抗到高感类型，气孔开度、密度和单位气孔面积的值均呈现增大的趋势；不同抗感炭疽病类型果实的表皮毛长度和密度的差异明显，由高到低依次均为高抗类型＞中抗类型＞中感类型＞高感类型。（5）果皮的pH值和相对电导率均随着果实抗病性的增强，表现出降低的趋势；果皮单宁、花青色、可溶性糖含量和PAL活性随着果实抗病性的增强，表现出增加的趋势。（6）相关分析和通径分析表明，各性状对发病率的作用效应依次为果色＞大小＞形状＞横径＞面积＞鲜重＞纵径；相对电导率＞pH值＞PAL活性＞花青素含量＞可溶性糖含量＞单宁含量。26 5.2讨论5.2.1果实植物学形态与炭疽病的关系油茶经过长期的自然和人工选择形成了众多不同的果实形态类型，这为优良品种选育提供了巨大的选择空间。本试验结果表明，纯青色、栗红果实几乎不发病，而青黄色果实发病率高达75.8%，青红相间的发病率介于两者之间，这与段琳等[61]研究的结果（红果抗病，青果感病，杂色果介于中间）大体一致，但在本研究中发现青果之间差异也很大，例如纯青果抗病性极强，青黄和麻青果极度感病；在果实形状、大小方面：球形、果大的较抗病，桃形的感病较重，这与陈守常等[62]的调查结果（球形或桃形，果小的果实类型发病率低）不完全相符。油茶果实的横径、大小、重量和面积均与果实炭疽病密切相关，随着果实感病程度的增加而降低。以上研究更加丰富了油茶果实形态学性状与抗病性的关系。炭疽病的发病率与果实主要的形态学性状之间的相关分析结果表明果实形态学性状与炭疽病之间具有很高的相关性。发病率与果实形状、颜色呈正相关，与果实大小、横径、纵径、重量和面积呈负相关），其中，发病率与形状和果实面积相关性较弱；果色与发病率呈显著正相关。说明果色和大小与发病率联系较密切，按照栗红、纯青、青红、青黄、麻青色果实发病率依次显著升高，果实越大，发病率有降低的趋势。性状对发病率的作用效应依次为果色(0.2821)＞大小(0.2415)＞形状(0.1097)＞横径（0.1000）＞面积(0.0703)＞鲜重(0.0467)＞纵径(0.0135)，可见果实颜色、大小和形状对炭疽病抗性贡献较大，因此在油茶抗病育种中,可以着重考虑选择果实颜色、大小和形状的特征的品系开展育种工作。5.2.2果实解剖结构与炭疽病的关系5.2.2.1油茶果皮解剖结构与抗炭疽病的关系植物体由于长期受到外界环境因素的影响，形成了与之相适应的形态、结构和生理功能，当植物受到病原菌的不断侵染后，可利用自身的结构抵御病原菌的侵入[63-64]。田丽波等[65]研究发现，高抗白粉病的苦瓜叶片蜡质含量明显高于高感叶片，认为蜡质层是其抵御和延缓病原菌侵入的最外层屏障；彭华胜[66]等研究表明，木瓜果实角质层、表皮细胞和薄壁组织等对其内部果皮以及种子都有保护作用，构成了多层防御病菌的防线。本研究发现，果皮总厚度、蜡质层、角质层和薄壁组织厚度越大的油茶果实，其抗炭疽病的能力越强，这与前人研究结果相符，说明果皮结构可能是油茶果实防御炭疽病菌侵染的有力屏障。5.2.2.2油茶果皮气孔结构与抗炭疽病的关系气孔在植物生长发育过程中具有重要的生理功能，是植物与外界进行水分和气体交换的重要途径，但也是部分病原菌侵染植物的重要通道，其大小、分布、形状和面积等直接影响病原菌侵染植物的成功几率[67-68]。据报道，油茶炭疽病菌27 可以通过自然孔道的途径侵染果实，如果果皮的气孔[69]。本试验观察到，感病油茶类型与抗病类型相比，果皮具有数量较多且开度较大的气孔，这种结构可能为病原菌的侵入提供了有利条件，增加了果实感病几率，这与颜惠霞等[70]的研究结果相符，而与魏爱丽等[71]等关于小麦抗病性与叶片气孔特性关系的结论相反，可能是由于果皮和叶片的结构差异所导致。5.2.2.3油茶果实表皮毛性状与抗炭疽病的关系本研究中抗病类型的油茶果皮单位面积上的表皮毛数量明显多于感病类型，且表皮毛的长度明显大于感病类型，这与一些学者(董金皋[72]、翟艳霞[73])的研究结果相一致。其机理可能是数量多而长的表皮毛可以有效地阻止炭疽病菌分生孢子在果实表面的附着和萌发，从而减少病原菌接触和侵染油茶果实表皮的机会。综合以上分析，油茶果皮解剖结构与其炭疽病的抗性紧密相关，是鉴定油茶果实抗病性强弱的重要指标。在今后的油茶抗病良种选育中，可将抗病类型果实的形态学特性与其生理生化特征相结合，以使选育方法、过程更加科学合理。5.2.3果皮生理生化特性与炭疽病的关系相关分析显示，发病率与pH值呈显著正相关(R=0.7065)，与相对电导率极显著正相关(R=0.8370)，与花青素含量和PAL活性呈极显著负相关性(R=-0.8202和-0.8251)。通径分析表明，相对电导率、pH值、PAL活性和花青素含量对发病率的决定系数较大，分别为0.4711、0.3670、0.2756和0.1417，这可能是因为植物组织相对电导率越低，表明细胞质电解液外渗的就越少，细胞受伤害越小，抗病性越强[74]；pH值较大的利于炭疽菌生长，其机理有待进一步研究；PAL是是苯丙烷类代谢途径的限速酶，是次生代谢的关键性酶，代谢过程中能生成植保素等抗病物质[50]；花青素是一种酚类化合物，当植物遭遇病菌侵入时可迅速合成和积累，有效抑制病菌侵入，保护细胞的完整性[75]。植物的抗病性是植物在形态结构和生理特性等方面综合表现的结果[77]，这也决定了抗病机制的复杂性。因此，在良种选育工作上可先通过果实形态学性状进行表型筛选，再对初选材料进行生理生化指标测定，以提高油茶抗病良种的选育效率。综上所述，由本试验结果可推断油茶抗病比较稳定的果实特征是：栗红色、纯青色、较厚的角质层、上表皮；较少的气孔；较多且长的表面茸毛；含量较多的花青素和较高的PAL活性；较低的相对电导率和pH值。28 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作者简介沈雅飞，女，满族，中共党员，1989年4月生于内蒙古赤峰市。2008年9月至2012年7月就读于内蒙古民族大学农学院园林专业，获农学学士学位；2012年9月至2015年7月就读于安徽农业大学林学与园林学院园林植物与观赏园艺专业，研究方向为经济林栽培及植物抗逆性生理。参加的科研项目安徽农业大学“大别山区农林特色产业协同创新中心”项目舒城县油茶产业提升关键技术集成与示范推广.省农业科技成果转化（1104a0303065）安徽省农转基金项目（编号：12040302005）在读期间发表的学术论文及科研成果1.沈雅飞,段文军,胡娟娟,等.油茶果皮解剖结构与炭疽病抗性的关系[J].植物保护,2015.2.沈雅飞,段文军,曹志华,等.油茶果实形态学性状、生理特性与炭疽病的关系[J].福建农林大学学报,2015.3.段文军,沈雅飞,曹志华,等.叶面肥对油茶容器苗叶片解剖结构和光合特性的影响[J].西北农林科技大学学报,2015,43(1):90-96.4.参编：《油茶栽培技术》，2013年1月出版中国科学技术出版社36
