表达apec ⅰ型菌毛的减毒鸡伤寒沙门菌重组疫苗的构建及免疫保护研究

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1、分类号学号ＭＺ１２４９ＱＵＤＣ密级ＹＡＮＧＺ朋ＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩＪ硕去学佐冶文（专业型）表达ＡＰＥＣ！型菌毛的减毒鸡伤寒沙口菌＇重纪疫苗的构建及免疫保护硏究王小舟指导教师姓名：朱国强教授，扬州大学，江劳扬州，２巧００９申请学位级别：硕去学科专业名称：兽医硕去论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期；２０１５年６月１：２０５年６月学位授予单位：扬州大学学位授予日期答辩委员会主席：郭爱珍教授■２０１５年５月

2、表达ＡＰＥＣＩ型菌毛的减毒鸡伤寒沙口菌重组疫苗的构建及免疫保护研究Ｃｏｎｓｔｒｕｅ村０田ｏｆｏｒａｌｌｙａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄａ竹ｅｎｕａｔ：ｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎ泣ｎｔ展＂仿１０？６化１仿Ｉ放舟ＷＭ／ｗｖａｃｃｉｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｅＩｆｉｍｂｒｉａｅｏｆａｖｉａｎａｔｈｏｅｎｉｃ必．ｃｏ／Ｚａｎｄｒｅｌａｆ；ｅｄｙｐｐｇｉｍｍｕｎｏｌｏｓｔｕｄｇｙｙ研究生：王小舟导师：朱国强教授扬州大学兽医学院２０１５年６月Ｉ

3、王小舟：表达ＡＰＥＣＩ型菌毛的减毒鸡伤寒沙口氏菌重组疫苗的构建及免疫保护研巧表达ＡＰＥＣＩ型菌毛的减毒鸡伤寒沙口菌重组疫苗的构建及免疫保护研究中文摘要鸡大肠杆菌病（ＣｈｉｃｋｅｎＣｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）是由禽致病性大肠杆菌（ａｖｉａｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ？如ｍ姗口ＣＯ化ＡＰＥＣ）引起的鸡体局部或全身性感染的传染病，是造成养禽业严重经一济损失的主要传染病之。目前，抗菌药物仍是防治鸡大肠杆菌病的主要措施，由此带来的生物安全问题受到广泛关注，。针对鸡大肠杆菌病

4、的防控采取疫苗预防与合理用药相结合的综合措施是最为行之有效的方法，开发强免疫效力且具有广谱保护性的。因此ＡＰＥＣ基因工程疫苗是解决该现状的一种有效途径新型。本研究选择减毒鸡伤寒沙口氏菌ＳＧ９Ｒ株为宿主菌－，Ｗａｓ苗基因为营养缺陷标志构建减毒鸡伤寒沙口氏菌染色体质粒平衡致死系统表达禽源大肠杆菌Ｉ型菌毛抗原，Ｗ探讨该重姐口服疫苗对预防鸡大肠杆菌病的保护效果。１．禽源大肠杆菌Ｉ型菌毛操纵子基因的克隆、表法及生物活性Ｌ：Ｊ、禽源大肠杆菌分离株ＣＥ２基因组ＤＮＡ为模板，采用长ＰＣ民

5、技术扩增出编码］型Ｂ民菌毛操纵子基因，克隆至表达质粒载体ｐ３２２，构建和筛选出含完整基因并正确插入的ｐＢＲ３２２？ｗ重组质粒，将该重组质粒转化至无菌毛的宿主大肠杆菌ＳＥ５０００。：／该表达重组菌能分别与鸡红细胞Ｄ－、酵母细胞发生明显的凝集反应且均能被甘露糖所抑串１Ｊ组菌与鼠抗Ｉ型菌毛亚单位蛋白ＦｉｍＡ高免血清产生明显的凝集反应。电镜观察；重到重组菌表面长满菌毛，利用该重组菌免疫小鼠制备抗血清经交叉吸附纯化后获得Ｉ型菌毛单因子血清，可有效用于禽源大肠杆菌Ｉ型菌毛表达的检测。用重组

6、菌ｐｆｉｍ进行人肺腺上皮细胞Ａ５４９体外粘附试验和粘附抑制试验，结果表明：重组菌ｐｆｉｍ和野生株ＣＥ２－均具有粘附肺腺上皮细胞的能力，且重组菌的粘附特性明显强于野生菌株，而Ｄ甘露糖能有效地抑制上述重组菌或野生菌株对人肺腺上皮细胞的粘附结合。这为开发ＷＩ型菌毛作为免疫原的基因工程疫苗的研制奠定了基础。２．禽伤寒沙口氏菌ＳＧ９Ｒ巧ｗｒｆ缺失株平衡致死系统平台的构建禽伤寒沙口氏菌ＳＧ９Ｒ弱毒株在预防禽伤寒中发挥着较好作用，为将ＳＧ９艮弱毒株开发为能携带外源基因的口服活疫苗载体且保

7、持其原有免疫原性，利用Ｒｅｄ同源重组系９Ｒ－统对ＳＧ株基因组中编码天冬氨酸Ｐ半醒脱氨酶的基因进行敲除，获得ＳＧ９民ＩＩ扬州大学硕±学位论文缺失突变株。该突变株在缺乏外源性ＤＡＰ培养条件下发生溶菌死亡，而在添加ＤＡＰ的培养基或导入携带ｆｌＷ基因的互补质粒后才能恢复生长，此为基础建立ＷａＷ基因为＇色体－质粒平衡致死系统营养缺陷标志的禽伤寒沙口民菌染。选择表达绿色巧光蛋白（畑Ｐ）基因作为报告基因，携带链球菌基因的ＰＹＡ３３４２质粒为表达载体，构建３３４２－ＧＦＰ）了表达

8、绿色巧光蛋白的重组菌ＳＧ９Ｒ（ＰＹＡ。该重组菌在体外传至４０代后，经巧光显微镜观察和流式细胞仪分析表明仍可稳定高效表达绿色羡光蛋白；同时，将该重狙菌曰服接种２０日龄仔鸡，发现其广泛分布于鸡的脾脏、肝脏及肠道组织等，体内稳定性试验表明重沮菌可在鸡体内停留２－３周。上结果表明该缺失株可凶用来作为宿主载体平衡致死系统来高效稳定表达外源基因，为弱毒禽伤寒沙口氏菌作为载体的基因工程活疫苗研制提供了优良的操作平台。３．禽巧大杨杆茵Ｉ型菌毛抗