mir172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究

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密级:（涉密论文填写密级，公开论文不填写）博士学位论文miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究作者姓名：赵晓晖指导教师:袁晓辉刘宝辉研究员中国科学院东北地理与农业生态研究所学位类别:理学博士学科专业:生态学培养单位:中国科学院东北地理与农业生态研究所2015年5月 TheFunctionsofmiR172anditsTargetsintheRegulationofPhotoperiod-mediatedFloweringinSoybeanByXiaohuiZhaoADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofScienceNortheastInstituteofGeographyandAgroecologyMay,2015 声明声明秉承研究所严谨的学风与优良的科学道德，本人声明文中除了特别加以标注和致谢的内容外，不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与本人合作的通知对本研究做出的贡献均已在文中予以明确说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者（签名）：日期： 保护知识产权声明保护知识产权声明本人完全了解中国科学院东北地理与农业生态研究所关于对研究生在研究所攻读学位期间撰写的论文知识产权保护的规定。本人撰写的论文是在导师的具体指导下，并得到相关研究经费支持下完成的。其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属于中国科学院东北地理与农业生态研究所。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为中国科学院东北地理与农业生态研究所。研究所有权保留学位论文及其电子版；研究所可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存本论文。（保密的论文在解密后也遵守此规定）论文作者（签名）：导师（签名）：日期： 目录目录摘要..................................................................................................................................................IAbstract..............................................................................................................................................III第一章绪论.......................................................................................................................................1第一节选题背景与研究意义...................................................................................................1第二节国内外研究进展...........................................................................................................3一、植物miR172及其靶基因功能的研究进展.........................................................3（一）miR172及其靶基因调控植物开花...........................................................3（二）miR172及其靶基因调控植物的生长发育...............................................4（三）植物miRNA靶基因的识别和鉴定..........................................................8二、大豆生育期基因的研究进展...................................................................................9（一）大豆生育期的划分.......................................................................................9（二）大豆主要生育期基因的研究现状..............................................................9三、光周期开花途径的研究进展.................................................................................11第三节研究内容与技术路线.................................................................................................13一、研究内容.................................................................................................................13（一）大豆miR172靶基因的识别和鉴定.......................................................13（二）大豆miR172及其靶基因的表达模式分析...........................................13（三）大豆miR172及其靶基因的功能研究...................................................14（四）大豆miR172及其靶基因参与的光周期调控开花途径研究...............14二、技术路线.................................................................................................................14第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定................................................................................16第一节材料与方法.................................................................................................................16一、大豆材料.................................................................................................................16（一）用于获得GmTOEs候选基因的大豆材料.............................................16（二）用于miR172靶基因鉴定的大豆材料...................................................16二、试验方法.................................................................................................................16（一）大豆中GmTOEs候选基因的获得.........................................................16（二）GmTOEs的聚类分析...............................................................................17（三）miR172靶基因的预测..............................................................................17 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究（四）miR172靶基因的鉴定..............................................................................17第二节结果与分析.................................................................................................................22一、大豆中GmTOEs候选基因的获得......................................................................22（一）筛选拟南芥TOE的同源基因.................................................................22（二）GmTOEs的聚类分析...............................................................................24（三）不同光照处理对GmTOEs候选基因的影响.........................................25二、大豆中miR172靶基因的预测............................................................................27（一）软件预测大豆中miR172的靶基因.......................................................27（二）GmTOEs蛋白保守结构域比对...............................................................28三、大豆中miR172靶基因的鉴定............................................................................29（一）5’-RACE实验原理及流程.......................................................................29（二）大豆miR172对其靶基因切割位点分析...............................................30第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析...................................................................34第一节材料与方法.................................................................................................................34一、大豆材料.................................................................................................................34二、试验方法.................................................................................................................34（一）取材方法.....................................................................................................34（二）大豆TotalRNA的提取...........................................................................35（三）mRNA的反转录.......................................................................................35（四）半定量PCR...............................................................................................36（五）实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）..................................................36（六）microRNA的检测.....................................................................................38第二节结果与分析.................................................................................................................41一、miR172及其靶基因GmTOEs的组织特异性表达模式..................................41二、miR172及其靶基因GmTOEs的时间调控表达模式......................................42（一）短日照条件下miR172及其靶基因的时间调控表达模式...................42（二）长日照条件下miR172及其靶基因的时间调控表达模式...................44三、miR172及其靶基因GmTOEs的昼夜节律表达..............................................46第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究............................................................................48第一节材料与方法.................................................................................................................48 目录一、试验材料.................................................................................................................48（一）大豆材料.....................................................................................................48（二）菌株.............................................................................................................48（三）质粒.............................................................................................................48（四）相关培养基.................................................................................................48（五）试剂.............................................................................................................49二、试验方法.................................................................................................................49（一）DNA的提取（CTAB法）.......................................................................49（二）总RNA的提取........................................................................................50（三）克隆引物设计.............................................................................................50（四）TA克隆载体的构建..................................................................................51（五）植物表达载体的构建................................................................................55（六）大豆的遗传转化（根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化法）................56（七）大豆转基因后代的鉴定............................................................................58（八）大豆转基因后代的表型观察....................................................................58第二节结果与分析.................................................................................................................58一、大豆miR172和GmTOE4a基因的克隆..........................................................58（一）大豆miR172的克隆................................................................................58（二）大豆miR172靶基因GmTOE4a的克隆..............................................60二、大豆转基因植株的鉴定与获得............................................................................63（一）除草剂的抗性检测.....................................................................................63（二）分子检测.....................................................................................................63三、大豆转基因植株的表型.........................................................................................64（一）miR172转基因大豆的表型......................................................................65（二）GmTOE4a转基因大豆的表型.................................................................67第五章大豆miR172及其靶基因参与的光周期调控开花途径研究.......................................72第一节材料与方法.................................................................................................................72一、大豆材料.................................................................................................................72（一）E1-E4近等基因系材料............................................................................72（二）转基因材料.................................................................................................72 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究二、试验方法.................................................................................................................73（一）取材方法.....................................................................................................73（二）大豆TotalRNA的提取.............................................................................73（三）mRNA的反转录.......................................................................................74（四）实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）..................................................74（五）microRNA的检测.....................................................................................74第二节结果与分析.................................................................................................................74一、miR172与其靶基因GmTOEs的调控关系.......................................................74（一）miR172c主要在叶片中对其靶基因GmTOE4a起抑制作用..............74（二）GmTOE4a过表达促进同家族基因的表达.............................................75（三）GmTOE4a基因反馈调控miR172..........................................................76二、miR172及其靶基因与生育期基因E3/E4的调控关系...................................77三、miR172及其靶基因与生育期基因E2的调控关系.........................................79四、miR172及其靶基因与生育期基因E1的调控关系.........................................81（一）E1调控miR172和GmTOE4a的表达................................................81（二）miR172负反馈调控E1...........................................................................82五、miR172及其靶基因与大豆成花相关基因的调控关系.....................................83（一）miR172c诱导大豆成花相关基因的表达................................................84（二）GmTOE4a抑制大豆成花相关基因的表达.............................................85六、miR172及其靶基因与GmCOLs的调控关系..................................................87七、miR172及其靶基因与miR156/GmSPLs的调控关系.....................................89（一）GmTOE4a调控miR156及其靶基因GmSPL3/9................................89（二）miR156调控miR172及其靶基因GmTOEs........................................90第三节小结.............................................................................................................................92第六章讨论.....................................................................................................................................93第七章全文结论.............................................................................................................................97参考文献...........................................................................................................................................99附表...............................................................................................................................................107发表文章.........................................................................................................................................109致谢...............................................................................................................................................110 摘要miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究摘要大豆[Glycinemax(L.)Merr.]作为重要的经济作物，是人类主要的植物油和植物蛋白来源。大豆开花期、成熟期和株高、主茎粗细等植株形态是影响大豆生产潜力的重要因素，阐明调控大豆开花期和植株形态的分子机理，是提高大豆产量潜力的关键科学问题。miR172及其靶基因APETALA2（AP2）类转录因子对植物开花和生长发育起着重要的调控作用，然而大豆中miR172及其靶基因对光周期调控开花的功能尚属未知。本研究以大豆Harosoy为材料，利用实时荧光定量PCR技术，在长、短日照条件下，分析miR172及其靶基因在不同生育时期、不同组织中的表达模式；利用分子生物学技术，克隆miR172及其靶基因，通过转基因技术分析它们在大豆光周期调控开花途径中的功能以及与大豆生育期基因间的相互作用关系，对深入探讨光周期调控大豆开花机制具有重要的学术价值，为分子设计育种提高大豆产量潜力提供理论依据。研究得出以下主要结果：一、大豆miR172靶基因的识别和鉴定根据拟南芥TOE蛋白序列，利用生物信息学等手段，在大豆中筛选到3个TOE同源基因：GmTOE4a、GmTOE4b和GmTOE3a。通过5’-RACE技术进一步证实了这3个TOE同源基因是大豆miR172的靶基因。二、大豆miR172及其靶基因的表达模式分析组织特异性表达模式分析结果表明：miR172a/b主要在叶片和茎尖中表达；miR172c主要在生殖器官中表达；GmTOE4a和GmTOE4b主要在营养器官中表达；而GmTOE3a在各个组织中均有表达。时间调控表达模式分析结果表明：miR172在幼苗期低表达，随着生长发育的进程逐渐增加，开花时达到最高值。GmTOE4a和GmTOE3a与miR172表达模式相反，而GmTOE4b与miR172相同。miR172及其靶基因的时空表达模式均与大豆的生长发育阶段相关。此外，GmTOEs表现出了双峰的昼夜节律表达模式。I 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究三、大豆miR172在光周期开花中的功能研究为了更好的研究miR172及其靶基因的功能，克隆了miR172家族成员miR172a和miR172c，以大豆品种Williams82为受体转基因。发现miR172a转基因株系没有表型变化；miR172c转基因株系在长、短日照条件下都提前开花，并且主茎的茸毛颜色提早变为棕色，标志着提前进行发育的时相转换，表明miR172c是大豆开花时间以及生长发育的重要调控因子。四、大豆GmTOE4a在光周期开花中的功能研究克隆了miR172的靶基因GmTOE4a，过表达GmTOE4a的大豆植株延迟开花，同时延迟从营养生长到生殖生长期的转换，而且植株形态也发生了变化，包括植株矮化、叶片变小、节间缩短和主茎增粗，呈现出了理想的大豆株形，成为增加抗倒伏能力、适应来自环境压力和提高大豆产量很有潜质的基因。因此，GmTOE4a基因不仅对大豆开花和发育起调控作用，而且对大豆的植株形态也有贡献。五、miR172及其靶基因参与的大豆光周期调控开花途径研究通过荧光定量PCR技术，在miR172c及其靶基因GmTOE4a转基因大豆中分析已知开花相关基因的表达模式。结果表明miR172及其靶基因GmTOE4a所参与调控的大豆光周期开花途径是在E3E4作用下，通过调控开花整合因子GmFT2a/5a以及花分生组织决定基因GmAP1和GmLFY来实现的。与模式植物拟南芥不同，miR172及其靶基因依赖于GmCOL1a的表达，而且在转录水平不受GI同源基因E2调控。此外，大豆miR172途径还与miR156及其靶基因GmSPL3/9有调控关系。更重要的是，miR172与豆科特有的转录因子E1基因之间存在着负反馈调节作用。最后，我们提出了miR172和GmTOE4a所参与的大豆光周期调控开花途径模式图。上述结果中，miR172及其靶基因参与的大豆光周期调控开花途径研究未见报道，属创新性研究。关键词：大豆；光周期开花；miR172；GmTOE4a；植株形态II 摘要TheFunctionsofmiR172anditsTargetsintheRegulationofPhotoperiod-mediatedFloweringinSoybeanAbstractSoybean[Glycinemax(L.)Merr.]isapredominantplantsourceforhumandiet,animalfeedsandbiodiesel.Thefloweringtime,maturityandplantmorphologyhavegreateraffectonsoybeanadaptationandgrainyield.Identificationofnovelgenesandunderstandingtheirmolecularbasisareverycriticaltoimprovesoybeanproductivity.ThetranscriptionfactorAPETALA2(AP2)istargetedbymicroRNAmiR172toregulatefloweringanddevelopmentinArabidopsis(Arabidopsisthaliana),andGIGANTEA(GI)-regulatedmiR172definesauniquegeneticpathwaythatregulatesphotoperiodicfloweringindependentofCONSTANS(CO).However,itisunknownwhatmiR172anditstargetsplayrolesinphotoperiodicflowering,therefore,inthisstudywefocusonthefunctionsofmiR172anditstargetsontheregulationofphotoperiod-mediatedfloweringinsoybean.TheresultsarehelpfulinunderstandingmiR172anditstargetsinvolvedinphotoperiodicfloweringgeneticpathway,aswellastheinteractionrelationshipwithsoybeanmaturegenes.Thiswilllaythefoundationforthesoybeanphotoperiodicmechanismandmolecularbreeding.Themainlyresultsareasfollows:InthisstudyweobtainedmiR172andTOEhomologsinsoybean,theyweremiR172a,miR172b,miR172c,GmTOE4a,GmTOE4bandGmTOE3a,respectively.AndthethreeGmTOEsaretargetedbymiR172confirmedby5’-RACEanalysis.MaturemiR172a/bweremainlyexpressedinleavesandstemtips,whereasmiR172cwasmuchhigherinreproductivetissue,especiallyinflowerbuds.LevelsofGmTOE4aandGmTOE4btranscriptwerecomplementarytomiR172c,mainlyexpressedinvegetativetissue,whileGmTOE3awasdetectedinalltissues.What’smore,theaccumulationofmiR172anditstargetstranscriptisalsoassociatedwithagebothunderlongday(LD)andshortday(SD)conditions,althoughGmTOE4bexpressionpatternwascontrarytoGmTOE3aandGmTOE4a.GmTOEsshowedaIII 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究bimodaldiurnalpattern,whilemiR172didnotshowanycircadianrhythms.TobetterunderstandthefunctionofmiR172anditstargets,wegeneratedmiR172andGmTOE4aover-expressionlinesinthesoybeancultivarWilliams82,respectively.ThemiR172aover-expressionlineswerethesameaswildtypeinphenotypes.ThemiR172cover-expressionlinesshowedearlyfloweringandweretransitiontoreproductivestageinadvance.TheGmTOE4aover-expressionlinesexhibitedlatefloweringanddelayedthetransitionfromthevegetativetothereproductivestage.Inadditiontotheeffectonfloweringtime,GmTOE4aalsoregulatestheplantmorphology,increasedthethicknessofstem,reducedplantheight,internodesandleafsize,whichareimportagronomictraitstoenhancethecapacityoftheresistancetolodgingandincreasesoybeanyield.miR172anditstargetsinvolvedinphotoperiodicfloweringgeneticpathwaywasmediatedbymaturitygenesE3andE4,whichencodingphotoreceptorsinsoybean,viarepressingthefloweringintegrators(GmFT2aandGmFT5a)andfloralmeristemidentitygenes(GmAP1andGmLFY).Inaddition,ourresultssuggestedthatmiR172andGmTOE4aregulatedfloweringinsoybeanisdifferentfrommodelplantArabidopsis,theyaredependentofthesoybeanCO-likegenesGmCOL.Besides,theexpressionofmiR172anditstargetswasnotregulatedbyE2,whichisahomologofArabidopsisGI.Interestingly,miR172pathwaywasrelatedwithmiR156anditstargetgenesGmSPL3/9.Moreimportantly,therewasanegativefeedbackregulationloopbetweenmiR172andE1,whichissoybeanspecifictranscriptionfactor.Finally,wesummarizedamodelofmiR172andGmTOE4ainvolvedinphotoperiodfloweringinsoybean.Keywords:Glycinemax,Photoperiodflowering,miR172,GmTOE4a,PlantmorphologyIV 第一章绪论第一章绪论第一节选题背景与研究意义大豆[Glycinemax(L.)Merr.]作为重要的经济作物，是人类主要的植物油和植物蛋白来源。大豆在国民经济中占有不可替代的位置，与国家粮食安全和国民经济可持续发展紧密相关。当前以大豆及大豆制品为主要原料的食品加工业和食用油加工业发展迅速，致使大豆的需求量迅速增长。然而，近年来由于作物种植的比较经济效益所致，我国大豆种植面积急剧缩减，总产量急剧下降，导致大豆对外依存度高达83.4%，严重威胁我国大豆食用油和大豆制品加工业的安全。从大豆生产发展战略的角度考虑，急需培育生态适应性广的大豆新品种，把大豆的种植领域向高纬度和高海拔地区推进，向低纬度和亚热带地区延伸，扩大种植面积，增加复种指数，以缓解大豆的供需矛盾。植物生命循环与环境变化是同步的，这一反应对于那些生长在高纬度的植物就显得尤为重要，因为在高纬度环境中，温度和光照长度的变化非常明显，植物必须具有感知和适应这种变化的机制才能得以生存（Garner和Allard，1923）。大豆是典型的短日照作物，即在昼夜周期中，日照长度短于某一临界值时才能够开花的植物，如果适当缩短日照、延长黑暗时间可促进其提前开花，相反，如果延长日照时间则延迟开花或者不开花（Garner和Allard，1920；1923）。大豆能够从赤道附近到纬度50度左右的广泛区域内进行栽培种植，尽管每个大豆品种的纬度适应范围很窄，仅为1-1.5度，这种广泛的生态适应性主要是由一些控制大豆光周期和生育期的基因或者数量性状位点（QuantitativeTraitLocus，QTL）的多样化来实现的。在大豆中，已经鉴定出了一系列与光周期和生育期相关的被称作E的基因位点，分别是E1、E2（Bernard，1971）、E3（Buzzell，1971）、E4（Buzzell和Volden，1980）、E5（Mcblain和Bernard，1987）、E6（Bonato和Vello，1999）、E7（Cober和Voldeng，2001）、E8（Cober等，2010）、E9（Kong等，2014）和J（Ray等，1995）。在模式植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）的光周期开花途径中，光受体感受光信号，并把信号传递给生物节律钟，由生物节律钟产生生物节律，然后将节律输出给下游的节律调节基因GI（GIGANTEA）。GI的表达和功能还会受到光1 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究受体的直接调控。节律调节基因通过输出基因CO（CONSTANS）调控下游开花时间基因如成花途径整合因子FT（FLOWERINGLOCUST）和SOC1（SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1）等基因的表达，从而激活或抑制花分生组织特征基因和花器官识别基因的表达控制开花，这是我们所熟知的拟南芥光周期调控开花途径。然而，Jung等在2007年研究发现了受GI调控的miR172途径，它是通过诱导FT表达而不依赖于CO的一条独特途径（Jung等，2007）。成熟的miR172为21nt，通过靶mRNA的降解和翻译抑制两种方式调控转录因子AP2及AP2-like基因（TOE1、TOE2、TOE3、SMZ和SNZ），无论在长、短日照下miR172过表达植株都表现出早花（Park等，2002；Chen，2004；Aukerman和Sakai，2003；Schmid等，2003；Schwab等，2005）。同样作为miR172靶基因的AP2-like基因GL15（GLOSSY15），是玉米中控制从营养生长到生殖生长的关键基因。虽然miR172没有被直接证明与开花相关，但是GL15活性增高不仅使幼叶增多，而且还延缓生殖发育。miR172对GL15-mRNA水平进行负调控，从而促进玉米幼叶向成熟叶转变（Lauter等，2005）。Zhu等（2009）的研究发现，miR172过表达可以引起水稻小穗缺失和花器官发育畸形，可育性降低。另外，miR172对开花时间的调控在烟草（N.benthamiana）中也有发现，这些都表明miR172在不同物种中调控开花和生长发育的功能是相对保守的。我国大豆主产区位于东北地区，地处高纬度，夏季日照时间相对较长，无霜期较短，对于短日照作物大豆开花而言面临严重挑战。长日照情况下，大豆晚花或者不开花，这样很有可能在无霜期来临之前不能收获或者不结实，势必严重影响大豆产量。因此，挖掘能够控制大豆花期的基因显得尤为重要，而miR172及其靶基因在其它物种中对开花时间调控的保守性，使得它们成为最好的候选基因，以期能够使大豆在无霜期较短、日照较长的高纬度地区开花结实。本研究以大豆为材料，对其进行不同的光周期诱导，分别检测miR172及其靶基因GmTOEs在大豆中的表达情况，初步阐明miR172及其靶基因的表达模式；通过5’-Race方法来鉴定大豆miR172的靶基因及切割位置；进一步通过大豆转基因的方法分析miR172及其靶基因在大豆光周期开花方面的功能，同时分析miR172及其靶基因在光周期途径中与E1、E2、E3、E4、GmFT2a、2 第一章绪论GmFT5a和GmCOL基因的上下游调控关系，最终阐明miR172及其靶基因所参与的光周期开花调控途径及与大豆生育期基因间的相互作用关系。本研究不仅能够完善大豆光周期反应机制的理论体系，而且为大豆分子育种奠定基础。第二节国内外研究进展一、植物miR172及其靶基因功能的研究进展MicroRNA（miRNA）是一类由20-24个核苷酸组成的内源非编码小分子RNA，不翻译产生功能蛋白，通过与其靶基因互补配对，在转录水平或者转录后抑制或者降解其靶基因，是多细胞机体基因调控网络中的重要成员（Ambros，2001；Bartel，2004）。植物miRNA具有多种功能，参与生长素信号传导与代谢、开花时间调控、花的发育、植物生长发育过程中的时相转换、应对逆境胁迫等功能。（一）miR172及其靶基因调控植物开花迄今的研究已经对拟南芥光周期调控开花的机制有了较为深入的了解，尤其miR172途径（Jung等，2007）的发现更是光周期开花调控途径研究中的一个重大突破。miR172通过调控其靶基因的表达，控制开花时间和花器官的形成，其靶基因为AP2（APETALA2）以及AP2家族（AP2-like）类的转录因子，此家族基因包括一个或者一个以上AP2保守结构域，由60-70个氨基酸组成，并且在每个AP2保守结构域中还有两个保守元件，分别为YRGmotif和RAYDmotif（Okamuro等，1997；Jung等，2007；Martin等，2009）。拟南芥中涉及开花时间的AP2类基因包括AP2基因本身、TARGETOFEAT（TOE1，TOE2，TOE3）、SCHLAFMÜTZE（SMZ）和SCHNARCHZAPFEN（SNZ）（Bowman等，1991；Jofuku等，1994；Aukerman和Sakai，2003；Jung等，2007；Huijser和Schmid，2011；Zhu和Helliwell，2011）。对于开花植物来说，花器官的发育在植物发育过程中是一个极为重要的阶段。miR172及其靶基因对植物开花时间和花器官的分化起关键的调控作用。在拟南芥中，除了TOE3基因外，过表达其中任何一个miR172的靶基因都会表3 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究现出延迟开花（Chen2004；Jung等，2007；Mathieu等，2009），最近报道，TOE3基因在拟南芥的开花转型和花的形态方面发挥重要作用（Jung等，2014）。与之相反，缺失功能的toe1突变体、toe1toe2双突变体toe1toe2smz三突变体、toe1toe2smzsnz四突变体以及toe1toe2toe3smzsnzap2六突变体均表现出了早花，而且早花的程度随着突变基因的增加而提前（Jung等，2007，2011；Yant等，2010），一方面说明AP2家族基因间存在着功能上的冗余，另一方面说明了AP2类基因对拟南芥的开花时间调控具有抑制作用。然而，过量表达miR172的植株不仅能够提前开花，而且还导致拟南芥非正常的花发育，包括花瓣缺失以及萼片向心皮的同源转化（Aukerman和Sakai，2003；Chen，2004；Jung等，2007，2011），表现出与ap2突变体一致的性状，却与其靶基因过表达的表型相反。AP2家族在花器官ABCModel中属于A类基因，若该类基因缺失，花被（Perianthorgans）会取代花结构中的生殖器官（Reproductiveorgans）（Jack，2004）。当在AP2与miR172结合的位置引入6个碱基突变，成为miR172的抗性基因，结果产生了大量的花瓣并且雄蕊退化（Chen，2004），与上述A类基因缺失的表型类似。短日照植物大花牵牛（Ipomoeanil），miR172的靶基因InAP2-like在幼苗期的子叶中表达量较高；在非诱导光长日照处理（16h光照/8h黑暗）条件下，InAP2-like的表达量增加而miR172的积累量却降低；与此相反，生长素、乙烯处理以及消除大花牵牛开花诱导的暗中断（Night-break）处理，InAP2-like的转录水平却明显降低（Glazińska等，2009）。这些结果表明miR172及其靶基因调控大花牵牛的开花诱导。另外，miR172在马铃薯（Solanumtuberosum）的开花调控中也有报道（Martin等，2009）。总结拟南芥中miR172及其靶基因的研究，以及其它物种中的同源基因，可以看出miR172及其靶基因在植物开花方面起着举足轻重的调节作用，包括开花时间、花分生组织的形成以及花器官的发育等。（二）miR172及其靶基因调控植物的生长发育在植物的生长发育过程中包括营养生长阶段和生殖生长阶段，而营养生长阶段又可以分为幼年期和成年期，开花则是植物进入生殖生长的重要标志。4 第一章绪论1.miR172及其靶基因对植物生长发育的调控在拟南芥的生长发育过程中，miR172的表达呈现出逐渐增加的趋势，并且在花芽中的表达量最高，而其靶基因TOE1、TOE2、SMZ和SNZ的表达量却随着生长发育逐渐降低，在生殖器官花芽中并不表达（Aukerman和Sakai，2003；Jung等，2007，2011）。靶基因的表达模式刚好与miR172互补，且它们的表达均随着生长发育时期而发生变化，因此，miR172和它的靶基因在植物的生长发育方面也起调控作用。单子叶植物玉米（Zeamays），通过转基因的方式过量表达miR172的靶基因glossy15（gl15），gl15属于AP2-like基因，转基因植株不仅增加幼叶的数量而且延迟进入生殖生长阶段，表明gl15基因能够维持幼年期的特征，抑制玉米从幼年期向成年期的转变。此外，在玉米幼苗中，miR172的积累量较高，而gl15的转录水平却很低，情况与拟南芥中的表达一致，表明miR172通过调控其靶基因gl15调节幼叶向成熟叶的转变（Lauter等，2005）。模式植物水稻（Oryzasativa），miR172在营养生长后期和花序发育时高表达，尽管在花序发育时期穗中的表达有所减弱，当受精10天后已经检测不到miR172的表达。在水稻的整个生长发育过程中，miR172在茎叶中呈现逐渐增加的趋势，并在剑叶中表达最高。在营养生长末期和生殖生长初期的积累量最高，表明miR172与花序发育以及花序起始发育的时相转换有关（Zhu等，2009）。水稻miR172的靶基因SUPERNUMERARYBRACT（SNB）和Os03g60430在叶片中大量富集，尤其在剑叶中表达量最高，与在拟南芥和玉米中同源基因的检测结果一致，表明调控营养生长阶段的功能是保守的。然而，在生殖生长阶段，miR172的靶基因SNB和Os03g60430在花序发育的时候表达量也很高，而此时miR172的积累量也处于高表达的水平。在水稻中miR172与其靶基因的表达并没有像其他物种中呈现出互补的模式，虽然已经用5’RACE实验鉴定了SNB和Os03g60430确实是miR172的靶基因（Zhu等，2009）。在miR172b的转基因水稻中，延迟小穗分生组织向花分生组织的转型，以致于引起水稻小穗缺失和花器官发育畸形，可育性降低等。然而，在miR172b的转基因株系中并没有检测到靶基因SNB表达量的降低，可能miR172在水稻的小花发育中抑制其它靶基因（如：Os03g60430）（Zhu等，2009）。5 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究马铃薯（Solanumtuberosum）为短日照植物，在诱导光照短日照条件下，miR172的表达水平比长日照处理高，并且块茎形成时在匍匐枝中上调表达。miR172的靶基因为RELATEDTOAPETALA21（RAP1）为包含有两个AP2保守结构的AP2-like基因。当miR172过表达时，其靶基因被下调表达，转基因马铃薯植株不仅能够提前开花，而且还能加速块茎的形成，即便是在非诱导光照条件下（Martin等，2009）。块茎的形成也是一个和生殖相关的发育过程，因此，表明miR172及其靶基因在马铃薯的生长发育过程中具有调控作用。马铃薯miR172主要分布在维管束组织中，并且通过嫁接实验证明了miR172具有可传递性（Martin等，2009）。因此，miR172有可能可以在维管束中移动，或者它可以调控长距离信号移动以此调节块茎的形成。另外，关于miR172可以长距离移动的报导在烟草（Nicotianabenthamiana）中也有发现（Kasai等，2010）。如果植物miR172可以长距离移动的特性在不同物种中是保守的，那么对于miR172功能的研究提供了一个快速而简捷的方法，并且可以保持其它原有的性状不发生任何改变，提供较为一致的遗传背景。关于miR172长距离移动的问题有待于在不同物种中做深入的研究。2.miR172与miR156共同调控植物的生长发育植物生命周期所经历的发育转型和发育时间是集外在和内在复杂的信号网络综合作用的结果，从上述各物种miR172及其靶基因的表达与功能可以看出，它们在植物生长发育过程中发挥调控作用，并且这种作用是相对保守的。此外，有报导miR172作用于miR156的下游促进植物成年特征（Adultepidermalidentity）的出现（图1-1）（Wu等，2009；Jung等，2011；Huijser和Schmid，2011）。miR156也是很保守的miRNA家族，在拟南芥、玉米和水稻等植物中都存在，其靶基因是SQUAMOSAPROMOTERBINDING-LIKE（SPL）转录因子，在发育转型时起作用，miR156是幼年期的主要调控因素（Schwab等，2005；Wu和Poethig，2006；Franco-Zorrilla等，2007）。拟南芥中SPL基因被划分两大类：SPL3/4/5参与开花时间和发育过程中的时相转换；SPL9和SPL15调控叶的起始以及时相转换（Cardon等，1997；Gandikota等，2007；Schwarz等，2008；Wang等，2008；Wu和Poethig，2006）。SPL3分布于茎尖组织，在播种15-22天后的幼苗中含量急剧上升，拟南芥中过量表达SPL3和SPL9刺激开6 第一章绪论花，而miR156过表达则通过下调SPL基因的活性使叶片数目增加，延迟开花（Schwab等，2005）。miR156在整个幼年营养生长阶段都有表达，在营养生长阶段的成年期转变过程中表达量减少。miR156的靶基因SPL通过对一类MADSbox基因的调控，控制了成年期到生殖生长期的转变（Wang等，2009）。miR156是植物生命周期转型的主要调控因子，不仅控制从营养生长阶段到生殖生长阶段的转变，还控制幼年期到成年期的转变。在玉米中，miR156由异时基因编码，伴随着miR156表达量的增加，植株分蘖数量增加，并且矮化（Chuck等，2007）。拟南芥的miR156转基因植株，叶柄会变长，叶片变小，与幼叶形态相似（Wu等，2006）。水稻中miR156过表达，表现出植株矮小，节数增加，分蘖数也大大增加，穗的枝梗数减少甚至无枝梗，并且延迟开花（Xie等，2006）。此外，还有报导miR156通过SPL9基因调控miR172的表达，SPL9和SPL10功能冗余的直接促进miR172b的转录（图1-1）（Wu等，2009；Huijser和Schmid，2011；Zhu和Helliwell，2011）。随后又有研究发现，在拟南芥的幼年向成年转型过程中，当miR172过表达时SPL3/4/5会上调表达，并且不依赖于miR156，因此，以基因SPL3/4/5为交叉点，miR172途径被归为miR156信号途径（Jung等，2011），miR156和miR172之间可能存在着一定的平衡关系，从而调控植物在适当的时间发育并完成发育阶段的时相转换，进而繁殖产生后代，以保证物种的延续。7 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图1-1miR156和miR172在生长发育时相转换中的调控模式图Fig.1-1AmodelfortheregulationofphasechangebymiR156andmiR172(HuijserandSchmid，2011)（三）植物miRNA靶基因的识别和鉴定植物miRNA与其靶基因的mRNA序列近乎完美的互补配对，因此，对miRNA靶基因的识别可以通过生物信息学扫描比对进行预测，然而预测的结果是否正确需要生物学实验的证实。目前，常用验证miRNA与其靶基因之间相互作用及生物功能的方法如下：1．农杆菌注射法（Agro-inoculation）：一般常用35S启动子分别构建miRNA及其靶基因的表达载体，然后用携带有载体系统的农杆菌注射接种烟草（Nicotianabenthiama）叶片，使两表达载体在叶片组织中共表达（Co-expression），为瞬时表达的一种方式（Llave等，2002；Kasschau等，2003）。2．小麦胚芽裂解物（wheat-germlysate）：利用小麦胚芽裂解物体外检测miRNA对其靶基因的切割活性（Mallory等，2005）。8 第一章绪论3．表达抗性靶基因法：在预测的靶基因与miRNA结合位点处引入几个碱基突变，但要保证靶基因编码的蛋白不改变，以此使得目标miRNA不能与其靶基因结合，此方法能够有效的验证miRNA与其靶基因的靶向关系（Jung等，2014；Mathieu等，2009；Chen，2004）。4．过表达miRNA：根据miRNA前体序列设计特异性引物，构建pre-miRNA到过表达载体上，然后通过转基因的方法验证目标miRNA的功能以及与其靶基因关系（Zhu等，2009；Jung等，2007），也是一种常用的方法。此方法与表达抗性靶基因法刚好相反。5．剪切产物5’RACE方法：miRNA在植物体内对其靶基因切割，对无帽子结构的剪切片段3’端添加接头，反转录后用基因特异引物扩增，克隆测序，测序结果与miRNA比对之后获知精确的剪切位点，是目前最为常用而且真实可靠的方法，因为体现的是植物体内的结果（Elbashir等，2001；Lauter等，2005；Glazińska等，2009；Mehrpooyan等，2012）。二、大豆生育期基因的研究进展（一）大豆生育期的划分大豆生育期是由多基因控制的数量性状,是重要的农艺性状,对大豆的产量、品质和适应性至关重要。生育期不仅指生育期长短，而且还包括生育期结构，即不同发育阶段的组成。生育期包括生育前期、生育后期和全生育期。生育前期是指出苗至开花的天数；生育后期是指开花到完熟的天数；全生育期是指出苗至完熟的天数。大豆的全生育期分为营养时期（VegetativeStage，VE—R1）和生殖时期（(ReproductiveStage，R1—R7），并将生殖生长时期与营养生长时期的长度之比（R/V）作为大豆生育期结构的衡量指标（Fehr和Caviness，1977）。（二）大豆主要生育期基因的研究现状大豆的生育期（开花期和成熟期）特别是开花期是大豆光周期反应的重要指标。经典遗传学的研究方法，对近等基因系进行比较，已发现了9个基因影响大豆的开花期和成熟期，分别是E1、E2（Bernard，1971）、E3（Buzzell，1971）、E4（Buzzell和Volden，1980）、E5（Mcblain和Bernard，1987）、E6（Bonato9 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究和Vello，1999）、E7（Cober和Voldeng，2001）、E8（Cober等，2010）、E9（Kong等，2014）和J（Ray等，1995），这些基因位点如果是显性则在自然昼长的情况下，表现为延迟大豆花期与延长大豆成熟期的作用，但是各个基因影响的大小却不一样（Cober等，1996a）。在已知的这些E基因中，大豆生育期基因E1对开花期及成熟期的影响最大（Abe等，2003；Bernard1971；Stewart等，2003）。Xia等（2012a）用Harosoy-E1（E1e2E3E4e5）与Harosoy（e1e2E3E4e5）建立的群体，成功地实现了该基因的精细图位克隆。E1基因含有一个双边核定位信号和DNA结合位点，并含有一个B3结构域，而且E1是豆科植物特有的转录因子，在短日照条件下，E1基因的表达受到明显抑制，而在长日照条件下则表现出双峰的昼夜节律模式，表明E1基因受光周期调控，而且长日照条件诱导E1的表达。以早花品种Kariyutaka为受体材料进行大豆转基因，E1基因过表达后表现出了明显的晚花，并且下调关键开花基因GmFT2a和GmFT5a的表达。这些结果表明E1基因在抑制大豆开花期和成熟期方面的起着关键作用，随着E1基因的成功克隆，以及对其作用机制的深入研究，可进一步揭示大豆特有的光周期反应及开花调控机制。大豆生育期基因E2为拟南芥GIGANTEA（GI）的同源基因GmGIa，Watanabe等（2011）成功克隆了E2基因。在拟南芥中，GI基因的表达受生物钟的调控，然后GI调控其下游基因CONSTANS（CO）的表达，从而作用于FT以调控开花；GI基因的在拟南芥光周期开花调控中的另一条途径为调控miR172及其靶基因TOE1，最终也是通过调控FT来调控开花（Jung等，2007）。大豆中，Watanabe等的研究发现，E2及其近等基因系材料在高纬度43°N和中纬度36°N的开花时间相近，表明E2基因对大豆开花期的调控可能不依赖于光周期（Watanabe等，2011）。从目前的研究结果来看，对E2基因的了解较少，Xia等（2012b）提出GI-CO-FT模式在大豆光周期反应或开花调控中的作用是否保守却犹未可知。大豆生育期基因E3和E4分别编码大豆光敏色素蛋白A3和A2（GmPhyA3，GmPhyA2），E3和E4基因不但与大豆的开花期和成熟期有关，同时也与对光周期的敏感性有关。大豆植株在人工控制的不同红光:远红光10 第一章绪论（R:FR）量子比的光质量下会产生不同的反应（Cober等，1996b）。通过用荧光灯以较高的R:FR比延长至20小时，第一次证实了E3位点，其隐形纯合体在长日照条件下早花（Buzzell，1971）。通过用白炽灯以低的R:FR比延长自然光至20小时，又发现了E4位点（Buzzell和Voldeng，1980），e4e4隐性等位基因并不能单独地对光周期产生不敏感性。因此，大豆植株在长日照条件下提前开花，必须携带隐性纯合基因e3（Buzzell和Voldeng，1980；Cober等，1996b；Saindon等，1989）。因此，E3和E4双显性基因型延迟开花和成熟，对光周期反应敏感；而纯合双隐性基因型提早开花和成熟，对光周期反应不敏感。E3基因的效应大于E4，并且对E4具有上位性作用（Saindon等，1989）。2009年Watanabe等利用图位克隆的方法将E3基因克隆出来，E3基因是大豆光敏色素A基因的一个拷贝（GmphyA3），此外，还发现E3位点在栽培品种中存在两种自然突变类型，一种是光敏色素第四个外显子缺失的Harosoy-e3类型，另一种是在第三个外显子上氨基酸置换的Misuzudaizu类型（Watanabe等，2009）。Liu等（2008）首次将E4基因克隆出来并证明其为大豆光敏色素A基因之一（GmphyA2），e4突变型是由于在GmphyA2基因第一个外显子上插入一个LTR型的反转录转座子，因此造成该基因失活。光敏色素A基因的另一个拷贝GmphyA1基因被定位在连锁群O，与连锁群I的E4位点区域是同源的。在连续的远红光下，纯合体e4等位基因的植株表现出黄化，也有部分非黄化的植株，表明e4单突变并不能促使GmphyA功能的完全丧失。三、光周期开花途径的研究进展随着分子生物学技术的不断进步和更新，拟南芥中对开花贡献起关键作用的基因已被鉴定和分离，对这些基因的研究，使得人们对植物开花调控的分子机制得以不断深入，归纳出五条调控拟南芥开花转变的途径,分别为光周期途径（Photoperiodpathway）、春化途径（Vernalizationpathway）、自主途径（Autonomouspathway）、赤霉素途径（GApathway）和成花抑制途径（Repressionpathway）（Thomas，2004）。植物在生命循环过程中，开花是一个很重要的标志，标志着植物由营养生长向生殖生长的重要转变，是在整合外界环境因子（如光、温度）和植物本身的内11 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究源信号基础上的外在表现（Kobayashi和Weigel，2007；Mouradov等，2002）。其中，“光”是影响植物开花很重要的环境因子之一，包括光强、光波的长短、光周期以及光的方向来源等复杂的光信号，然而，对开花调控起重要作用的是光周期（Cerdan和Chory，2003；Hayama和Coupland，2003）。植物能够随着日照长短的变化而改变开花的现象被称之为光周期现象（Photoperiodism），最早是由Garner和Allard在1920年提出来的（Garner和Allard，1920）。植物感知光周期的主要部位是叶片，其中的感光物质为光受体，包括吸收红光和远红光的光敏色素（Phytochrome）（Nagy等，2002）、吸收蓝光的隐花色素（Cryptochrome）和吸收绿光的向光素（Phototropin）（Briggs等，2002；Ulm等，2005）。模式植物拟南芥的光周期开花途径研究的较为透彻，首先通过光受体（Photoreceptors）感受光信号，然后传递此信号给生物节律钟（Circadianclock），由生物节律钟产生生物节律（Circadianrhythm），但并不是所有光受体调控的开花都是通过生物钟来实现的（Millar等，1995；Shirley等，1995）。然后将节律输出给下游的节律调节基因（Circadianregulatedgenes）GI（GIGANTEA）。GI的表达和功能还会受到光受体的直接调控。节律调节基因通过输出基因CO（CONSTANS）调控下游的开花时间基因（Floweringtimegenes），如成花途径整合因子（Floralintegrators）FT和SOC1等基因的表达，从而调控花分生组织特征基因（Floralmeristemidentitygenes）的表达，最终控制拟南芥的开花时间。CO基因是Putterill（1995）采用图位克隆的方法分离得到的，编码锌指蛋白转录因子，在光周期调控中起重要的调节作用，是植物生物钟与开花之间的桥梁。在韧皮部表达的CO基因激活能够开花物FT的表达，而且有实验证明FT是CO蛋白的直接作用底物（Suárez-López等，2001）。拟南芥FT蛋白转移至茎尖生长点，促使SOC1、LFY、AP1等基因表达，诱导植物开花（Huang等，2005）。然而，Jung等（2007）研究发现在拟南芥的光周期开花途径中GI除了调控CO的表达以外，还调控miR172及其靶基因TOE1，即便是在缺失功能的co突变体中过表达miR172，植株都会提前开花，无论在长日照还是短日照条件下（图1-2），因此，表明miR172促进光周期开花是不依赖于CO基因的一条独特途径，miR172途径的发现是对光周期开花调控途径的一个完善，具有重要的意义。12 第一章绪论图1-2miR172所调控的光周期开花途径Fig.1-2AmodelformiR172functioninphotoperiodicowering(Jungetal.2007)第三节研究内容与技术路线一、研究内容（一）大豆miR172靶基因的识别和鉴定根据拟南芥TOE的氨基酸序列在数据库http://www.phytozome.net/soybean中搜索大豆的同源基因GmTOEs，选择同源性在40%以上的基因序列，进行聚类分析和序列比对。在不同的光照条件下处理大豆品种Harosoy，通过半定量PCR的方法，筛选受光周期调控的GmTOEs候选基因。对得到的GmTOEs候选基因用5’-Race方法来检测和鉴定是否为miR172的靶基因。（二）大豆miR172及其靶基因的表达模式分析利用实时荧光定量PCR方法，分别在长日照（16h光照/8h黑暗）和短日照（12h光照/12h黑暗）条件下，分析miR172及其靶基因GmTOEs的组织特异性表达、时间调控表达以及昼夜节律表达，以此解析miR172及其靶基因的表达模式。13 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究（三）大豆miR172及其靶基因的功能研究分别构建miR172及其靶基因的过表达载体，利用根癌农杆菌介导法转入野生型大豆Williams82中，获得稳定遗传的转基因植株。在长日照（16h光照/8h黑暗）和短日照（12h光照/12h黑暗）条件下，观察并记录转基因大豆株系的花期以及植株形态等表型特征，以明确miR172及其靶基因的功能。（四）大豆miR172及其靶基因参与的光周期调控开花途径研究长日照（16h光照/8h黑暗）条件下，在miR172及其靶基因的转基因大豆植株以及Harosoy近等基因系材料中，分析miR172和GmTOEs与大豆生育期基因（E1、E2、E3、E4）、GmCOLs、开花整合因子（GmFT2a和GmFT5a）以及成花相关基因（GmAP1、GmSOC1和GmLFY）的调控关系，解析大豆miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花途径中的作用。二、技术路线本研究的技术路线如图1-3所示。14 第一章绪论图1-3研究流程及基本框架Fig.1-3Researchflowchartandframework15 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定第一节材料与方法一、大豆材料本研究的大豆材料在人工气候室内培养，控制恒温25℃，采用红光（R:660nm）和远红光（FR:730nm）的比值（R:FR）为1.2的光质条件，光照强度为300μmolm−2s−1。（一）用于获得GmTOEs候选基因的大豆材料用于获得GmTOEs候选基因的大豆材料为Harosoy，设置不同的光照处理，分别为SD3（短日照处理3天）、SD6（短日照处理6天）、LD22（长日照处理22天）、LD10SD6（长日照处理10天，然后再转移至短日照处理6天）、LD10SD6LD3（长日照处理10天后转移至短日照处理6天，然后再转移至长日照处理3天）和LD10SD6LD6（长日照处理10天后转移至短日照处理6天，然后再转移至长日照处理6天），短日照处理为12h光照/12h黑暗，长日照处理为16h光照/8h黑暗。各处理结束后取完全展开的幼嫩叶片，分别取3株，然后将样品混合提取总RNA。（二）用于miR172靶基因鉴定的大豆材料用于大豆miR172靶基因识别和鉴定的大豆材料为Harosoy，设置短日照（SD，12h光照/12h黑暗）处理20天，取完全展开的幼嫩叶片，分别取3株，然后将样品混合提取总RNA。二、试验方法（一）大豆中GmTOEs候选基因的获得用已公布的拟南芥TOE1（At2g28550）、TOE2（At5g60120）和TOE3（At5g67180）的氨基酸序列，在大豆基因组网站http://www.phytozome.net/soybean筛选出与拟南芥同源的大豆GmTOEs序列，16 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究选择同源性在40%以上的基因序列用于后续研究。（二）GmTOEs的聚类分析下载筛选到的大豆GmTOEs蛋白序列，利用MEGA5.0软件，用Neighbor-Joining（NJ）方法构建系统发生树，设置Bootstrap值为1000。（三）miR172靶基因的预测通过在线数据库psRNATargethttp://plantgrn.noble.org/psRNATarget/对大豆miR172靶基因进行预测，输入候选基因GmTOEs的转录序列，选择大豆（Glycinemax）miRNAs（miRBaseRelease19，August2012）。为了减少假阳性率，互补序列长度设置值为21，Maximumexpection值为2.5。（四）miR172靶基因的鉴定采用Invitrogen公司GeneRacer试剂盒（L1502-01）进行5’RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）实验。1.TotalRNA的提取（Trizol方法）实验中的RNasefree进口的离心管、微量移液器枪头、研钵等均在121℃高压灭菌40min后烘干，低温密封保存。采用Ambion公司的TRIzol®Reagent（15596-026）。（1）取50-100mg大豆材料，置于加液氮预冷的研钵中研磨，加1mlTRIzol继续研磨成细末状，让液氮挥发但不要融化，移至1.5ml离心管中。（2）室温放置5min，加0.2ml氯仿，涡旋剧烈震荡使样品成匀浆状，室温放置2-3min。（3）4℃下12,000g离心15min。（4）转移上层水相至新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，-20℃静置30min。（5）4℃下12,000g离心10min，弃上清。（6）加270µl灭菌水溶解沉淀，然后加30µl10×DNaseⅠbuffer，2µlDNaseⅠ（RNasefree），37℃进行DNA消化60min。17 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定（7）加等体积的Tris饱和酚，涡旋振荡，4℃15,000rmp离心10min。（8）上清移至新的1.5ml离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24:1），涡旋振荡（可抽提2遍）。（9）4℃15,000rmp离心10min，上清移至新的1.5mL离心管中，加1/103MNaAc（pH5.2），2.5倍体积的无水乙醇。颠倒混合后，-30℃静置至少30min以上，沉淀RNA。（10）4℃15,000rmp离心10min，弃上清，加1ml75%乙醇清洗RNA沉淀。温和振荡，4℃7,500×g离心5min。（11）弃上清，室温空气中干燥RNA沉淀5-10min，不可过于干燥，否则RNA很难溶解。（12）加入20-50µlRNasefree的水，轻弹溶解RNA。1×TAE溶液配制1%的琼脂糖凝胶，100V电泳15-20min，检查RNA的完整性。对获得的RNA溶液保存于-80℃。2.5’-RACE实验的基因特异性引物设计基因特异性引物（GeneSpecificPrimers，GSPs）设计原则：（1）引物长度23-28nt，以增加特异性结合的能力。（2）GC含量50-70%，保证较高的退火温度。（3）3’末端的最后5个碱基中少于两个GC。（4）引物3’端的3-4个碱基不要与配对引物形成互补序列。（5）Tm值≥72ºC，高的退火温度可以增加PCR产物的特异性。（6）采用TouchdownPCR方法，可以明显增加PCR产物的特异性，减少非特异扩增。在最开始的循环中，退火温度高于引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降低，进行后续的PCR循环。18 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究表2-1用于5’-RACE实验的引物序列Table2-1Primersusedfor5’-RACEPrimerSequence（5’-3’）BasesCGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACRNAOligo44UGAAGGAGUAGAAAGeneRacer™5’Primer(F)CGACTGGAGCACGAGGACACTGA23GmTOE4bgsp1(R)TCCTAAGAGAACTGGAGCACTCAA24GmTOE4agsp1(R)CCATGAGCAACAACATTGTACCGA24GmTOE3agsp1(R)CCAGAGCGAGTTCCCAAATTGGCTTTCCCTAT323.LigatingtheRNAOligotoDecappedmRNA（1）取5µgtotalRNA（7µl）加入0.25µgRNAOligo中。（2）65ºC孵育5min（可能挥发1µl）。（3）冰上放置2min，简单离心。（4）在该离心管中继续加如下试剂：10×LigaseBuffer1µl10mMATP1µlRNaseOut™(40U/µl)1µlT4RNAligase(5U/µl)1µlTotalVolume10µl（5）37ºC温育1h后，瞬时离心置于冰上。（6）加入90µlRNase-FreeH2O和100µl的苯酚/氯仿，涡旋振荡30s混匀。（7）室温离心，12000g×5min，上清（~100µl）移入1.5ml新离心管。（8）分别加入2µl10mg/ml糖原，10µl3MNaAc(pH5.2)，220µl95%的乙醇，轻混后冰上放置10min。（9）4ºC离心，12000g×20min，弃上清。（10）500µl70%乙醇清洗沉淀，干燥后用10µl的DEPC水溶解。19 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定4.ReverseTranscribingmRNA（1）反转录反应如下：LigatedRNA10µlPrimers（50µM）1µldNTPMix(10mMeach)1µlSterile,distilledwater1µlTotalVolume13µl（2）65ºC温育5min，冰上2min，简单离心。（3）在该离心管中继续加如下试剂：5×FirstStrandBuffer4µl0.1MDTT1µlRNaseOut™(40U/µl)1µlSuperScript™IIIRT(200U/µl)1µlTotalVolume20µl（4）混匀后50ºC温育30-60min。（5）70ºC15minutes终止反转录反应，冰上2min。（6）加入1µl的RNaseH(2U)，37ºC温育20min。获得第一链cDNA分装后-20ºC保存，每次可使用1-2µl做模板进行PCR扩增。5.AmplifyingcDNAEnds（1）扩增反应体系如下：GeneRacer™5′Primer,10µM3µlReverseGSP,10µM1µlRTTemplatecDNA1µl10×Ex-TaqBuffer5µldNTPs,2.5mMeach4µl20 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究Ex-Taq0.5µlMgSO,50mM2µlSterile,distilledwater33.5µlTotalVolume50µl（2）TouchdownPCR程序：TemperatureTimeCycles94°C2minutes194°C30seconds572°C30seconds94°C30seconds570°C30seconds94°C30seconds65°C30seconds2572°C30seconds72°C10minutes1（3）PCR反应结束后，2%的琼脂糖凝胶电泳检测。6.Gel-PurifyingPCRProducts（1）片段大小正确的条带切胶。（2）切下的胶转移至试剂盒中的S.N.A.P.™柱子上，室温离心，12000g×1min。（3）获得15-60µl的纯化产物，测浓度备用。7.CloningandSequencingPCRProduct（1）连接反应，反应体系如下：FreshPCRproduct0.5-4µlSaltSolution1µlWateraddtoatotalvolumeof5µlTOPO®vector1µlFinalVolume6µl21 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定（2）轻轻混匀上述反应体系，简单离心，室温放置5min（30s-30min）。（3）连接反应结束后置于冰上。8.转化与挑单克隆测序（1）取100µl感受态悬浮细胞，加入上述6µl连接产物，轻弹混匀，冰上静止20min。（2）42°C热激45s，速放冰上2min，加入500µlLB无抗培养基，37°C摇床160rpm复苏30min。（3）室温离心，4000rpm×1min，弃大部分上清，留下100-150µl，重悬混匀后涂板（LB，Amp+），37°C过夜培养。（4）挑取白斑，做菌落PCR鉴定插入片段大小，对于鉴定正确的单克隆过夜摇菌，质粒提取后进行EcoRI酶切验证。（5）鉴定正确的阳性质粒送Invitrogen测序，每个基因送10-12个单克隆。（6）在NCBIblast中进行测序结果与靶基因切割位点的分析。第二节结果与分析一、大豆中GmTOEs候选基因的获得据报道，在模式植物拟南芥中，miR172通过抑制其靶基因AP2以及AP2-like基因（TOE1，TOE2，TOE3，SMZ和SNZ）的转录和翻译来调控开花（Schwab等，2005；Jung等，2007；Mathieu等，2009），因此，我们通过筛选拟南芥TOE同源基因，在大豆中进行研究。（一）筛选拟南芥TOE的同源基因根据拟南芥AtTOE1（At2g28550）、AtTOE2（At5g60120）和AtTOE3（At5g67180）的氨基酸序列在数据库http://www.phytozome.net/soybean中搜索大豆的同源基因GmTOEs，选择同源性在40%以上的基因序列。结果如表2-2所示，其中获得AtTOE1基因的同源序列9个，AtTOE2基因的同源序列2个，AtTOE3基因的同源序列8个。因其属于同一个家族，所以在这些序列中22 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究有交叉的GmTOEs序列，因此，共获得拟南芥TOE的同源基因11个，分别为Glyma01g39520、Glyma03g33470、Glyma05g18170、Glyma10g22390、Glyma11g05720、Glyma11g15650、Glyma12g07800、Glyma13g40470、Glyma15g04930、Glyma17g18640和Glyma19g36200。表2-2：拟南芥TOE的同源基因Table2-2TOEhomologsinsoybean拟南芥AtTOE大豆GmTOE相似度（%）Glyma01g3952044.0%Glyma03g3347058.4%Glyma10g2239040.3%Glyma11g1565053.9%TOE1Glyma12g0780058.8%At2g28550Glyma13g4047061.2%Glyma15g0493063.4%Glyma17g1864041.4%Glyma19g3620055.4%TOE2Glyma11g1565042.6%At5g60120Glyma12g0780052.3%Glyma01g3952044.9%Glyma03g3347042.3%Glyma05g1817045.2%TOE3Glyma11g0572040.9%At5g67180Glyma11g1565042.3%Glyma15g0493042.9%Glyma17g1864044.9%Glyma19g3620042.6%23 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定（二）GmTOEs的聚类分析将上述11个大豆GmTOEs氨基酸序列（表2-3）与拟南芥的AtTOE1、AtTOE2和AtTOE3蛋白序列进行聚类分析，结果如图2-1所示，大豆GmTOE1a、GmTOE1b、GmTOE4a、GmTOE4b、GmTOE5a和GmTOE5b与拟南芥的AtTOE1聚在一起。GmTOE2a、GmTOE2b、GmTOE3a和GmTOE3b与拟南芥的AtTOE3聚为一枝。而GmTOE6和AtTOE2与其它的TOE序列不能聚在一起，表明这两个蛋白与AtTOE1和AtTOE3的同源关系较远。表2-3GmTOEs基因名称和序列号Table2-3LocusIDofGmTOEsusedinthestudyGenenameLocusIDDatabaseGmTOE6Glyma10g22390GmTOE5bGlyma11g15650GmTOE5aGlyma12g07800GmTOE4bGlyma13g40470GmTOE4aGlyma15g04930GmTOE3bGlyma01g39520PhytozomeGmTOE3aGlyma11g05720GmTOE2bGlyma05g18170GmTOE2aGlyma17g18640GmTOE1bGlyma19g36200GmTOE1aGlyma03g3347024 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图2-1大豆GmTOEs与拟南芥TOE蛋白序列的系统发生树Fig.2-1PhylogenetictreeshowingtheTOEhomologsofArabidopsisinsoybeanTOE系统发生树用MEGA（Ver.5.0）程序构建，分支上的数字表示Bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。ThephylogenetictreewasconstructedinMEGA(Ver.5.0)usingtheneighbor-joiningmethod.ThenumbersattheclusternodesrepresentthepercenthomologyamongTOEsasverifiedbybootstrap.（三）不同光照处理对GmTOEs候选基因的影响对筛选到的11个大豆GmTOEs基因设计特异性引物，在大豆材料Harosoy中通过半定量PCR的方法，检测11个GmTOEs基因分别在不同光照条件下处理不同时间的表达水平，设置的处理分别为SD3、SD6、LD22、LD10SD6、LD10SD6LD3和LD10SD6LD6（详见第一节材料与方法）。结果显示，GmTOE1a、GmTOE1b、GmTOE2a、GmTOE2b、GmTOE5a、GmTOE5b和GmTOE6基因的表达量对于长、短日照以及长短日照交替处理均没有变化，而GmTOE3b虽然不同的光照处理对其表达量有影响，但是表达量很低（图2-2）。因我们关注的是受光周期调控的基因，所以对于长短日照没有变化以及表达量很低的GmTOEs基因不做考虑。因此，最终筛选得到3个GmTOEs基因，分别为GmTOE3a（Glyma11g05720）、GmTOE4a（Glyma15g04930）和GmTOE4b（Glyma13g40470），在不同的光照条件下发生相应的变化，表明参与了大豆光周期调控开花。此外，我们筛选到的3个候选基因与在数字基因表达谱（本课题组内部资料）中的结果一致（图2-3）。25 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定图2-2大豆GmTOE同源基因在不同光照条件下处理不同时间的表达水平Fig.2-2TranscriptionprofilesofsoybeanGmTOEhomologsunderdifferentphotoperiodsfordifferentlengthsoftime大豆材料Harosoy出苗见光后设置不同的光照处理，分别为：SD3（短日照处理3天）、SD6（短日照处理6天）、LD22（长日照处理22天）、LD10SD6（长日照处理10天，然后再转移至短日照处理6天）、LD10SD6LD3（长日照处理10天后转移至短日照处理6天，然后再转移至长日照处理3天）和LD10SD6LD6（长日照处理10天后转移至短日照处理6天，然后再转移至长日照处理6天），短日照处理为12h光照/12h黑暗，长日照处理为16h光照/8h黑暗。ThesoybeancultivarHarosoywasused.Afteremergence,theplantsweregrownunderdifferentphotoperiodsfordifferentlengthsoftime:1,SD3;2,SD6;3,LD22;4,LD10SD6(exposedtoLDfor10days,thenshiftedtoSDfor6days);5,LD10SD6LD3(exposedtoLDfor10days,thenshiftedtoSDfor6days,thenshiftedtoLDfor3days);6,LD10SD6LD6.Atleastthreeleafsampleswerecollectedfromdifferentplants4hoursafterdawn.β-tubulin(GmTUB)wasusedasanormalizationcontrol.26 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图2-3数字基因表达谱中GmTOE基因的表达模式Fig.2-3ExpressionofGmTOEgeneinDigitalGeneExpressionProfiling二、大豆中miR172靶基因的预测（一）软件预测大豆中miR172的靶基因由于植物microRNA与其靶基因高度的互补配对（允许有0-3个错配），所以通过在线数据库psRNATargethttp://plantgrn.noble.org/psRNATarget/预测候选基因与microRNA的互补配对程度便可知是否为期望的靶基因。对于上述获得的3个候选基因GmTOE4b、GmTOE4a和GmTOE3a通过此方法预测是否为大豆miR172的靶基因。预测结果如表2-4所示，miR172家族的3个成员miR172a、miR172b和miR172c均能够与3个GmTOEs候选基因结合，并且分别与每个基因的结合位点都是一致的，结合在GmTOE4b基因CDS序列的1919-1939碱基处，GmTOE4a基因CDS序列的1826-1846碱基处，GmTOE3a基因CDS序列的1771-1791碱基处。恰好这3个结合位点均位于每个基因的最后一个外显子上，而且与在拟南芥、水稻、玉米和大麦中的情况一致（Zhu和Helliwell，2011），表明miR172与其靶基因的结合识别位点在进化上是保守的。此外，靶基因的预测结果还显示这3个GmTOEs基因都具有AP2结构域转录因子的活性（表2-4）。综上，预测的结果初步确认GmTOE4b、GmTOE4a和GmTOE3a是大豆miR172的靶基因，并且miR172所调控的靶基因也趋于保守，为含有AP2结构域的转录因子，但预测结果还需要进一步的实验鉴定。27 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定表2-4大豆miR172候选靶基因的预测Table2-4ListofmiR172/PredictedTargetPairsinsoybeanExpectationTargetTargetAcc.miRNAAcc.AlignmentInhibition(E)DescriptionGma-miR172a1.51919-1939Glyma13g40470Gma-miR172b1.51919-1939CleavageGmTOE4bGma-miR172c1.01919-1939Gma-miR172a1.51826-1846AP2domainGlyma15g04930Gma-miR172b1.51826-1846CleavagetranscriptionGmTOE4afactoractivityGma-miR172c1.01826-1846Gma-miR172a2.51771-1791Glyma11g05720Gma-miR172b2.51771-1791CleavageGmTOE3aGma-miR172c0.51771-1791（二）GmTOEs蛋白保守结构域比对miR172通过调控AP2以及AP2家族类基因来调控植物开花以及发育等（Schwab等，2005；Jung等，2007；Mathieu等，2009；Huijser和Schmid，2011），因此，用已报导的拟南芥TOE1和AP2氨基酸序列与3个GmTOEs候选基因的蛋白进行多重序列比对。结果显示，大豆GmTOEs蛋白与拟南芥TOE1和AP2的结构域一致，都包含2个AP2保守结构域，并且都具有AP2结构域中保守的YRGmotif和RAYDmotif（图2-4），表明大豆GmTOEs可能与拟南芥的TOE1和AP2蛋白具有功能上的相似性，进一步表明GmTOE4b、GmTOE4a和GmTOE3a是大豆miR172的靶基因，但仍需要实验验证。28 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图2-4GmTOEs蛋白的AP2结构域Fig.2-4AP2domainsofGmTOEs大豆GmTOE3a、GmTOE4a和GmTOE4b与已知的拟南芥AP2和TOE1蛋白序列多重比对。序列上面的黑线表示AP2结构域，红色框内为AP2结构域中保守的YRG和RAYDmotifs。MultiplealignmentofproteinsequencescomparingtheAP2domainsoftheGmTOE3a,GmTOE4aandGmTOE4bwithknownAP2andTOE1inArabidopsis.ThelinesabovethesequencesindicatethetwoAP2domains.Theredboxesnotethecompletelyconservedsequencemotifs(YRGandRAYDmotifs)ineachAP2domain.三、大豆中miR172靶基因的鉴定（一）5’-RACE实验原理及流程5’RACE（5’cDNA末端快速扩增）是直接分析miRNA与其靶基因相互作用的一种方法，用于miRNA对其靶mRNA剪接位点的识别。由于植物miRNA与其靶基因高度互补配对，并且主要通过切割靶基因的mRNA来行使功能，因此，5’RACE方法很适合植物miRNA靶向关系验证。本研究采用5’RACE方法来验证miRNA与预测的靶基因间的靶向关系。原理为：先从TotalRNA中富集回收mRNA，然后在被miRNA切割的mRNA5’端连接RNA接头，之后对连上接头的mRNA进行反转录反应。根据靶基因设计基因特异性引物，以反转录产物cDNA为模板进行巢式PCR扩增，对扩增出的特异条带进行克隆、测序（图2-5），从而最终验证植物体内是否存在预测的断裂靶基因的mRNA，并且最终确定精确的剪切位置，以此来证实预测的基因是miRNA的靶基因。29 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定图2-55’-RACE实验流程Fig.2-5Flowchartof5’-RACE（二）大豆miR172对其靶基因切割位点分析1.TotalRNA的提取5’RACE实验要求TotalRNA的纯度较高，并且完整性较好，因此，对于用TRIzol方法获得的TotalRNA要做琼脂糖凝胶电泳检测。本研究所用的大豆材料为Harosoy短日照（SD，12h光照/12h黑暗）处理20天的叶片。电泳结果显示TotalRNA的28S条带亮度是18S的2倍，且完整性较好（图2-6），可以用于后续的5’RACE实验。30 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图2-6TotalRNA检测Fig.2-6DetectionofTotalRNA2.克隆GmTOEs基因的被剪切产物在植物体内miR172已经完成对其靶基因的切割，因此，在上述获得的TotalRNA中已经存在被切割的靶mRNA片段。对这个mRNA片段的5’端连接接头、反转录后获得cDNA。用GeneRacer5’Primer和基因特异引物GSP1以反转录产物cDNA为模板进行巢式PCR扩增，为了减少非特异扩增采用TouchdownPCR方法。结果如图2-7A所示，有非特异扩增，切胶回收后进行第二轮PCR，获得单一条带（图2-7B）。若扩增出的条带回收的量少，可以重复第二轮PCR，直至获得足量的特异条带用于克隆。将克隆片段连接克隆载体pCR4-TOPO，菌落PCR（图2-8）鉴定正确后，送Invitrogen公司测序。图2-7PCR扩增Fig.2-7PCRamplificationM：核酸分子量标准DS2000；1和4-6：GmTOE4b；2和7-9：GmTOE4a；3和10-12：GmTOE3aM：MarkerDS2000；Lane1，4-6：GmTOE4b；Lane2，7-9：GmTOE4a；Lane3，10-12：GmTOE3a31 第二章大豆miR172靶基因的识别和鉴定图2-8载体pCR4-TOPO-GmTOE转化大肠杆菌PCR鉴定结果Fig.2-8PCRcertificationresultsoftransformingE.coliwithpCR4-TOPO-GmTOEM：核酸分子量标准DS2000；1-21：扩增结果；22：阳性对照；23：阴性对照（模板为水）M：MarkerDS2000；Lane1-21：PCRamplificationproductoftransformingE.coliwithpCR4-TOPO-GmTOE；Lane22：positivecontrolwithcDNAastemplate；Lane23：negativecontrolwithdistilldeionizedwaterastemplate3.miR172的切割位点对上述miR172切割产物的克隆测序结果进行分析，分别与GmTOE4b、GmTOE4a和GmTOE3a基因的CDS全长序列比对，同时与miR172家族的序列进行比对，用以获得GmTOEsmRNA在5’端的切割位点。测序结果表明，GmTOE4b、GmTOE4a和GmTOE3a这3个基因与miR172互补配对结合位置的碱基序列都是相同的（图2-9），并且与在数据库中预测的结果一致，证明了miR172在进化上的保守性。而且，miR172对这3个基因切割频率最高的位点相同，都位于miR172成熟体的第10和第11个碱基之间（图2-9），结果与32 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究其它物种中miR172对其靶基因的剪切位点一致（Lauter等，2005；Zhu等，2009），表明miR172对其靶基因的作用方式也是保守的。综上，5’RACE实验的结果表明GmTOE4b、GmTOE4a和GmTOE3a是大豆miR172的靶基因。图2-9miR172对其靶基因GmTOEs的切割位点Fig.2-9Gma-miR172cleavagesitesinGmTOEsmRNA注：小写字母表示错配。Lowercaselettersindicatemismatches.箭头表示切割位置。Thearrowindicatescleavagesite.数字表示切割频率。Thecleavagefrequencies(numberofcloneswiththeexpectedcleavagesite/totalnumberofclonessequenced)areshowntotherightofthesequencealignment.33 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析第一节材料与方法一、大豆材料用于大豆miR172及其靶基因表达模式分析的大豆材料为Harosoy，植株在人工气候室内培养，控制恒温25℃，采用红光（R:660nm）和远红光（FR:730nm）的比值（R:FR）为1.2，光照强度为300μmolm−2s−1。长日照处理（LD）为16h光照/8h黑暗，短日照处理（SD）为12h光照/12h黑暗。二、试验方法（一）取材方法1.取材时间（1）组织特异性表达短日照条件下处理15天（15DAE，DaysAfterEmergence）时，分别取植株完全展开的幼嫩叶片、茎尖生长点以及根；观察到肉眼可见的饱满花芽时取花芽；当花完全展开时取花；豆荚形成1周时取豆荚。（2）时间调控表达从出苗后第3天开始取样，每3d取一次，短日照（SD）处理持续到36DAE，长日照（LD）处理持续到51DAE。（3）昼夜节律表达出苗后分别在长、短日照条件下处理9天，从光照开始的那一刻起第一次取样，接下来每4h取一次叶片，以24h为一个周期，每株大豆只能取样一次，不可以在同一株重复取样。2.取材部位：时间调控和昼夜节律表达分析实验取完全展开的新生幼嫩叶片。3.取材方法：每株取幼叶1片，每份材料取3株，混合在一起于取样袋中，迅速置于液氮中，然后转移至-80℃保存。34 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究（二）大豆TotalRNA的提取Trizol方法提取总RNA，同第二章。（三）mRNA的反转录总RNA经DNaseI（Promega）处理后，以琼脂糖凝胶电泳与ThermoScientificNaNoDrop2000c相结合的方法检测RNA的质量和浓度，对于质检合格的RNA用SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR试剂盒（Invitrogen）进行反转录。（1）在0.2mlRNase-free离心管中加入：TotalRNA2μgdNTPMix(2.5mMeach)4μloligodT(10µM)2μlRNase-freewater补足体积TotalVolume13μl（2）混匀，65℃5min，冰上2min。（3）在同一离心管中加入：5×FirstStrandBuffer4μlDTT(0.1M)2μlM-MLV1μlTotalVolume20μl（4）冰上混匀后42ºC温育60min。（5）99ºC5min终止反转录反应，冰上2min，获得第一链cDNA。（6）获得的cDNA，用内参基因β-tublin的特异引物进行反转录效率和有无基因组DNA污染的验证（β-tublin引物跨内含子区，有DNA污染会导致杂带），对于成功反转的cDNA-20ºC保存备用。35 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析（四）半定量PCR半定量PCR在整个操作过程中使用进口枪头及PCR管，严谨加样，并时刻校正移液器进样的准确性。首先取稀释10倍的cDNA3μl为模板进行β-tublin的PCR扩增，取10μl产物电泳。根据电泳结果适当调整各样品模板量，并用去离子水补足差量，然后进行β-tublin的第二轮PCR。直至电泳条带亮度基本一致为止，记录每个模板量，以此模板量使用基因特异引物，用优化的PCR条件进行特异基因的PCR扩增，并比较各个样品的条带亮度分析结果。半定量PCR反应体系见表3-1。表3-1：半定量PCR反应体系Table3-1Thereactionsystemofsemi-quantitativePCR10×cDNAaµl10×Ex-TaqBuffer5µldNTPs,2.5mMeach4µlPrimer-F(10µM)1µlPrimer-R(10µM)1µlEx-Taq0.3µlSterile,distilledwaterbµlTotalVolume50µl（五）实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）1.引物设计实时荧光定量PCR引物长度18-24nt，特异性强，产物长度在200bp左右。引物效率、退火温度及特异性需经过PCR验证及预实验，溶解曲线要在一个很窄的温度范围内，拐点一致并形成一个很尖的峰，即溶解温度一致，表明此引物可以使用。本实验中所用的实时荧光定量PCR引物见表3-2。36 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究表3-2：实时荧光定量PCR引物Table3-2PrimersusedforReal-timePCR引物名称引物序列碱基数产物长度PrimerNamePrimerSequence（5’-3’）Bases(bp)Productlength(bp)β-Tublin-FGAGAAGAGTATCCGGATAGG20400β-Tublin-RGAGCTTGAGTGTTCGGAAAC20GmTOE4b-FGATTGGAACCATCGCTCGAA20189GmTOE4b-RGACTCGGCAGTCAGATTAAG20GmTOE4a-FATGAGAGCGAGATGAAACCT20257GmTOE4a-RGGGAAAGAAAGTGGAATATAC21GmTOE3a-FACTAAGCCATTCTAAAGGGA20179GmTOE3a-RTCCGATCCATCTTCAACTAC202.反应体系及程序反转录获得的模板cDNA稀释10倍后使用。用于Real-timePCR的引物为上下游引物的混合液，浓度为1.2µM，即分别取10µM上下游引物各72µl加入同一管内，再加468µl超纯水。反应体系及程序见表3-3和3-4。加样时严格的冰上操作，需要冷启动，否则引物二聚体及非特异扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是在模板含量较低时。整个操作过程中需要戴无粉乳胶手套，并时刻校正移液器进样的准确性。SYBRGreen染料易见光分解，在使用和加样过程中需要遮盖避光，并尽量避免反复冻融。表3-3：实时荧光定量PCR反应体系Table3-3ThereactionsystemofReal-timePCR模板cDNA（10×）5µlPrimerMix（1.2µM）5µl2×SYBRGreen10µlTotalVolume20µl37 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析表3-4：实时荧光定量PCR反应程序Table3-4ThereactionprocedureofReal-timePCRStageTemperatureTime195°C5min295°C10s3Dependingonthegene20s472°C20s5PlateRead678°C2s7PlateRead8Gotoline2for39moretimesMeltingCurvefrom72°Cto95°C,92sreadevery2.0°C3.数据分析方法检测SYBRGreen（GreenqPCRSuperMix-UDG试剂盒，Invitrogen）染料掺入双链DNA后发出荧光形成的扩增循环数CT，以稳定和高效表达的大豆β-tublin基因作为定量内参基因，使用2-△△Ct相对定量法计算基因相对表达量，扩增效率在70-110%的结果认为是可信的。在Bio-RadDNAEngineChromo4多色实时荧光定量PCR仪上进行Real-timePCR检测，每个样品进行3次以上的独立重复实验。（六）microRNA的检测对于miR172的检测使用microRNA检测试剂盒（GeneCopoeia，USA），按说明书进行操作。1.引物设计实时荧光定量方法（qRT-PCR）检测microRNA，上游的特异引物根据要检测的microRNA成熟体序列进行设计，条件与试剂盒中的反向通用引物接近：Tm=64.5,GC%=50%（表3-5），snRNAU6作为内参（Turner等，2013）。38 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究表3-5：miR172qPCR检测引物Table3-5PrimersformiR172qPCRanalysis引物名称引物序列碱基数产物长度PrimerNamePrimerSequence(5’-3’)Bases(bp)Productlength(bp)q172ab-FGCGCTAGAATCTTGATGATGCTGCAT2679q172c-FTCGCTGGAATCTTGATGATGCTGCAG2679U6-FGGAACGATACAGAGAAGATTAGCA2471U6-RTTTGGACCATTTCTCGAT18注：下划线标注的碱基是为了提高退火温度。2.加A、反转录及荧光定量PCR检测利用PolyAPolymerase对成熟体microRNA的3’端进行“PolyA”加尾处理，同时使用M-MLVRTase及OligodTAdaptor对PolyA化的RNA进行反转录。合成好的cDNA模板通过上游特异的microRNA定量引物和下游的通用引物进行定量PCR，microRNA实时荧光定量PCR检测原理见图3-1。图3-1microRNA实时荧光定量PCR检测原理Fig.3-1TheprincipleofmicroRNAqRT-PCRdetection（1）microRNA加A及反转录反应使用总RNA，要求其完整性较好，必须包含小分子量的RNA。反应体系为：TotalRNA2µg2.5U/µlPolyAPolymerase1µlRTaseMix1µl39 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析5×ReactionBuffer5µlddH2O(RNase-/DNase-free)补足体积TotalVolume25µl（2）冰上混匀后37ºC温育60min。（3）85ºC5min，终止酶的活性。（4）获得的cDNA模板稀释10倍作为工作液。（5）microRNA实时荧光定量PCR反应体系：2×All-in-OneqPCRMix10µlmiRNAqPCRPrimer(2µM)2µlUniversalAdaptorPCRPrimer(2µM)2µlFirst-strandcDNA(diluted1:10)2µlddH2O(RNase-/DNase-free)4µlTotalVolume20µl（6）microRNA实时荧光定量PCR反应程序见表3-6。表3-6：microRNA实时荧光定量PCR反应程序Table3-6ThereactionprocedureofmicroRNAqRT-PCRStageTemperatureTime195°C10min295°C10s360°C20s472°C20s5PlateRead678°C2s7PlateRead8Gotoline2for39moretimesMeltingCurvefrom72°Cto95°C,92sreadevery2.0°C（7）microRNA检测结果的处理方法采用2-△△Ct相对定量法。40 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究第二节结果与分析为了清楚的了解miR172及其靶基因GmTOEs的功能，我们首先对其表达模式进行了分析，分别包括miR172a/b和miR172c的成熟体，GmTOE4a、GmTOE4b和GmTOE3a的组织特异性表达、时间调控表达和昼夜节律表达。一、miR172及其靶基因GmTOEs的组织特异性表达模式将大豆材料Harosoy在诱导光短日照（SD）条件（12h黑暗/12h光照）下处理，在处理15天时（15DAE）分别取植株完全展开的幼嫩叶片、顶端分生组织以及根；当形成肉眼可见的饱满花芽时取之，此时为光照处理后的20天（20DAE）；当花完全展开时取花；豆荚形成1周时取豆荚。检测结果如图3-2所示，成熟体miR172a/b主要在叶片和顶端分生组织中表达，根、花芽、花和荚中的表达量比较低。而其同一家族miR172c的表达模式刚好与miR172a/b相反，在叶片、顶端分生组织和根中的表达量比较低，而在生殖器官中比较高，尤其在花芽中表达量最高（图3-2A），这与拟南芥miR172在花芽中表达强烈（Jung等，2007）的结果一致，而当花完全展开和荚形成的时候miR172c的表达逐渐降低，表明miR172c可能是大豆开花的促进因子。miR172a/b和miR172c的空间表达模式不同，可能它们的功能也不完全相同。miR172的靶基因GmTOE4a和GmTOE4b在大豆的叶、顶端分生组织和根中均有表达；进入生殖生长阶段产生花芽时，表达量很微弱；当开花以后，在生殖器官花和荚中，已经检测不到GmTOE4b和GmTOE4a基因的表达。而GmTOE3a基因的表达没有组织特异性，在被检测的6个组织中均有表达（图3-2B）。GmTOE4a和GmTOE4b的空间表达模式刚好与miR172c相反，表明它们可能是大豆开花的抑制因子。41 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析图3-2miR172和GmTOEs的组织特异性表达Fig.3-2Tissue-specificexpressionpatternsofmiR172andtheGmTOEsLF：叶；ST：茎尖；RT：根；FB：花芽；F：花；P：荚A:Tissue-specificexpressionofmiR172underSD(shortday,12hlight/12hdark)conditions.qRT-PCRanalysisofmiR172expressionlevels,U6snRNAwasusedasanormalizationcontrol.B:Semi-quantitativeRT-PCRanalysisofGmTOEstissue-specificexpressionlevelsunderSDconditions.β-tubulin(TUB)wasusedasanormalizationcontrol.LF,leaves;ST,stemtips;RT,roots;FB,flowerbuds;F,flowers;P,pods.Allsampleswereharvested4hoursafterdawn.Biologicaltriplicateswereaveraged二、miR172及其靶基因GmTOEs的时间调控表达模式（一）短日照条件下miR172及其靶基因的时间调控表达模式在大豆诱导光短日照（SD）条件下，miR172a/b和miR172c的时间表达调控模式基本相同。幼苗期时，miR172的表达量很弱，但是在大豆的整个营养生长阶段miR172的表达呈现出增加的趋势，尤其在营养生长后期是一个激增的过程。在短日照（SD）处理后的24天（24DAE），即大豆Harosoy的始花期，miR172的积累量达到顶点，然后当进入生殖生长阶段时逐渐降低（图3-3A和B）。结果再一次表明miR172可能是大豆开花的诱导因子。然而，GmTOE4a和GmTOE3a的表达模式与miR172相反，幼苗期高表达，然后随着生长发育逐渐降低，在20DAE时，即花芽阶段降到最低。自此之后又开始逐渐增加，但在生殖生长后期再一次降低（图3-3C和D）。GmTOE4a和GmTOE3a基因在短日照42 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究（SD）条件下的时间调控表达模式与mi172互补，并且是miR172的靶基因，因此，再次证明GmTOE4a和GmTOE3a可能抑制大豆开花。然而，GmTOE4b与GmTOE4a和GmTOE3a基因的表达情况相反，而与miR172相似，只是最低点提前至18DAE（图3-3E），与拟南芥TOE3基因的表达模式一致，受miR172调控的TOE3基因被证明在开花转型和花的结构（floraltransitionandfloralpatterning）中起主要作用（Jung等，2007，2014），因此，GmTOE4b很有可能在功能上与TOE3基因相似，在大豆花的发育方面起作用。图3-3短日照条件下miR172和GmTOEs的时间调控表达模式Fig.3-3ThetemporalexpressionpatternsofmiR172andtheGmTOEsunderSDconditionsA-B:Timecourse-dependentexpressionofmiR172a/bandmiR172cunderSD(shortday,12hlight/12hdark)conditions.U6snRNAwasusedasanormalizationcontrol.C-E:Timecourse-dependentexpressionofGmTOEsunderSDconditions.β-tubulin(TUB)wasusedasanormalizationcontrol.Thesampleswerecollectedeverythreedays,from3to36DAE.Allsampleswereharvested4hoursafterdawn.DAE,daysafteremergence.Biologicaltriplicateswereaveraged43 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析（二）长日照条件下miR172及其靶基因的时间调控表达模式长日照（LD，16h光照/8h黑暗）条件下，miR172a/b的表达随着大豆的生长发育呈现出一直增加的趋势，当观察到花芽开始形成时（30DAE），miR172a/b增加的速率加快，一直持续到取样结束（51DAE）（图3-4A）。而miR172c的表达量虽然从幼苗开始就一直增加，但是到开花的时候（42DAE）达到最高，然后开始逐渐下降（图3-4B），呈现出与短日照处理相似的表达模式（图3-3B）。长日照（LD）处理后，miR172a/b和miR172c的时间表达模式略有不同，再次表明它们的功能可能也不尽相同。miR172的靶基因GmTOE4a、GmTOE3a和GmTOE4b的表达模式完全不同。GmTOE4a幼苗期的表达量较高，而后逐渐降低，在15-24DAE这段时间持续低表达，然后又开始逐渐增加。很有趣的是在高表达一段时间之后GmTOE4a又出现一个很明显的降低过程（39-48DAE），而此时恰好是miR172c高表达的时间（图3-4B），也恰逢Harosoy在长日照（LD）处理下的开花时间。然后，在开花结束后GmTOE4a的表达又增加（图3-4C）。与GmTOE4a相同的是在大豆幼苗期GmTOE3a的表达量也很高，并且在整个被检测时期中是最高的阶段，然后逐渐下降，但是在30-39DAE的花芽形成阶段出现了一个稍微增加的小峰，而后基本保持平稳的表达，但是比幼苗期的积累量要低（图3-4D）。结果表明，GmTOE4a和GmTOE3a在幼苗时期高表达，花期低表达，因此，它们可能是大豆开花的抑制因子，并且与短日照（SD）的结果一致。然而，GmTOE4b的时间调控表达模式与GmTOE4a和GmTOE3a的截然不同。在大豆幼苗阶段持续的低表达，当花芽开始形成的时候逐渐增加，在48DAE时表达量达到最高，然后开始降低（图3-4E）。与其在短日照（SD）条件下的模式（图3-3E）很相似。再一次表明GmTOE4b的功能可能与GmTOE4a和GmTOE3a的不同，而与拟南芥TOE3基因相似。44 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图3-4长日照条件下miR172和GmTOEs的时间调控表达模式Fig.3-4ThetemporalexpressionpatternsofmiR172andtheGmTOEsunderLDconditionsA-B:Timecourse-dependentexpressionofmiR172a/bandmiR172cunderLD(longday,16hlight/8hdark)conditions.U6snRNAwasusedasanormalizationcontrol.C-E:Timecourse-dependentexpressionofGmTOEsunderLDconditions.β-tubulin(TUB)wasusedasanormalizationcontrol.Thesampleswerecollectedeverythreedays,from3to51DAE.Allsampleswereharvested4hoursafterdawn.DAE,daysafteremergence.Biologicaltriplicateswereaveraged综合以上长、短日照处理下miR172及其靶基因GmTOEs的时间调控表达模式的实验结果，能够与大豆生长发育各时期吻合，miR172可能是大豆开花的诱导因子，GmTOE4a和GmTOE3a可能是大豆开花的抑制因子。然而，关于miR172及其靶基因GmTOEs的功能有待于后续实验证实。45 第三章大豆miR172及其靶基因的表达模式分析三、miR172及其靶基因GmTOEs的昼夜节律表达为了阐明miR172及其靶基因GmTOE3a、GmTOE4a和GmTOE4b在转录水平与大豆开花的关系，我们分别在不同的光照条件下分析了它们的昼夜节律表达模式。无论在短日照（SD，12h光照/12h黑暗）还是长日照（LD，16h光照/8h黑暗）条件下，miR172的表达量都基本保持恒定（图3-5A和B），没有表现出昼夜节律，结果与拟南芥中miR172的模式一致（Jung等，2007）。然而，miR172的靶基因GmTOEs的表达模式却与之不同，呈现出双峰的表达模式（图3-5C和D）。大豆Harosoy植株在短日照（SD）条件下光照后4h，GmTOEs的转录水平达到最高值，随后的4h表现为降低的趋势，继而在光照后12h出现第二个峰值，GmTOEs的转录水平在黑暗中逐渐降低，在光照之前达到最低值。长日照（LD）条件下，也是在光照4h后GmTOEs的表达出现第一个峰值，然后又在光照后16h出现第二个表达峰。通过以上的实验结果可以看出，GmTOEs基因的表达呈现出有规律的昼夜节律，无论在短日照（SD）还是长日照（LD）条件下，光照后4h出现第一个表达峰，第二个表达峰的出现恰好是在由光照到黑暗的瞬间，即短日照在处理后的12h，长日照在处理后的16h。然后随着暗处理时间的增加，GmTOEs的表达逐渐降低，当给予光处理后，又呈现增加的趋势，直到4h后达到最高点。综上，实验结果表明，miR172没有昼夜节律的变化；而其靶基因GmTOEs的表达却呈现出昼夜节律变化，因此，GmTOEs基因除了受到miR172的调控以外，极有可能还受到生物钟基因的调控。此外，不同的光照时间GmTOEs的第二个表达峰出现时间也不同，因此，GmTOEs基因的表达还受到光周期的调控。这些结果还有待于进一步的实验验证。46 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图3-5miR172和GmTOEs的昼夜节律表达Fig.3-5DiurnalexpressionofmiR172andGmTOEsunderSDandLDconditionsA-B:DiurnalexpressionofmiR172underSD(12hlight/12hdark)andLD(16hlight/8hdark)conditions.U6snRNAwasusedasanormalizationcontrol.C-D:DiurnalexpressionofGmTOEsunderSD(12hlight/12hdark)andLD(16hlight/8hdark)conditions.β-tubulin(TUB)wasusedasanormalizationcontrol.Thesampleswerecollectedevery4hoursat9DAE.Biologicaltriplicateswereaveraged47 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究第一节材料与方法一、试验材料（一）大豆材料Williams82：由中国科学院遗传与发育研究所李霞实验室惠赠，作为大豆转基因的受体材料。（二）菌株1.大肠杆菌（Escherichiacoli）：Trans1-T1购自TransGen公司。2.根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciems）：EHA101由中国科学院大豆分子设计育种重点实验室保藏。（三）质粒1.克隆载体：pCRⅡ购自Invitrogen公司。2.植物超表达载体：pTF101.1由中国科学院大豆分子设计育种重点实验室保藏。（四）相关培养基1.YEP固体培养基蛋白胨10g/L+酵母粉10g/L+NaCl5g/L+Agar12g/L，pH7.02.发芽培养基（GerminationMedium，GM）B5盐3.1g/L+B5有机+蔗糖20g/L+phytagel5.3g/L，pH5.83.共培养培养基（Co-CultivationMedium，CCM）1/10B5盐+B5有机+MES3.9g/L+BAP1.6mg/L+GA30.25ml/L+AS0.04g/L+DTT154mg/L+L-Cysteine400mg/L+蔗糖30g/L+Washedagar8g/L，pH5.448 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究4.芽诱导培养基（ShootInductionMedium，SIM）B5盐3.1g/L+B5有机+BAP1.6mg/L+蔗糖30g/L+MES0.6g/L+Phytagel3g/L，pH5.7，Cef200mg/L，Cb200mg/L，Timentin50mg/L，Glufosinate8mg/L5.芽伸长培养基（ShootEnlongationMedium，SEM）MS盐3.1g/L+B5有机+MES0.6g/L+Asp50mg/L+Glu50mg/L+IAA0.1mg/L+Zeatin-R1mg/L+GA3500ug/L+蔗糖30mg/L+Phytagel3g/L，pH5.7，Cef200mg/L，Cb200mg/L，Timentin50mg/L，Glufosinate4mg/L6.生根培养基（RootingMedium，RM）MS盐3.1g/L+B5有机+蔗糖20mg/L+MES0.6g/L+Asp50mg/L+Glu50mg/L，Phytagel3g/L，pH5.6，Cef200mg/L，Timentin50mg/L，Cb200mg/L（五）试剂主要分子试剂：RNA提取试剂TRIzol(Invitrogen)，反转录酶M-MLV(Invitrogen)，高保真酶KOD-Plus-NEO(TOYOBO)，西班牙进口琼脂糖(Biowestagarose)，EB替代染料(Solarbio)，琼脂糖凝胶回收及质粒提取试剂盒(Axygen)，rTaq酶(TaKaRa)，限制性内切酶(NEB，TaKaRa)，DNAMarker(东盛)。引物合成和测序在Invitrogen北京公司完成。二、试验方法（一）DNA的提取（CTAB法）1.2%CTAB提取液（表4-1）放入60ºC的水浴中预热30min；表4-12%CTAB提取液的配制Table4-1Preparationof2%CTABextractionbuffer试剂用量1MTris-HCl(pH8.0)100ml0.5MEDTA40mlNaCl81.8gCTAB20gddH2O定容至1L49 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究2.在液氮速冻的条件下将约0.1g大豆幼嫩叶片研磨成细粉末状态，转移至2ml离心管中，加入预热的2%CTAB提取液；3.混匀后放入60ºC的水浴中30min，每隔10min上下颠倒一次；4.室温冷却后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，12000rpm，离心10min；5.吸上清（剪枪头先端，下同）至新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm，离心10min；6.吸上清至新的2ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20ºC沉淀60min；7.4ºC，12000rpm，离心10min，弃上清；8.加入150µlddH2O，溶解后加等体积的4MLiCl，4ºC过夜沉淀RNA；9.15000rpm，离心20min，吸上清至新的1.5ml离心管中；10.加入3倍体积的无水乙醇，-20ºC沉淀30min；11.4℃，15000rpm，离心20min，弃上清；12.加入150µl70%乙醇，4ºC，15000rpm，离心5min，弃上清；13.室温挥发或真空干燥，然后加入150-300µlTEBuffer溶解DNA；14.测浓度，电泳检测。（二）总RNA的提取Trizol方法提取总RNA，同第二章。（三）克隆引物设计1.miR172引物设计根据小RNA数据库miRBasehttp://www.mirbase.org中大豆miR172a和miR172c前体茎环信息和大豆全基因组序列http://www.phytozome.net/，分别在茎环结构两侧设计上下游引物，并添加酶切位点（表4-2）。50 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究2.GmTOE4a基因引物设计根据数据库Phytozomehttp://www.phytozome.net/公布的大豆GmTOE4a基因（Glyma15g04930）的CDS全长序列设计引物，并添加酶切位点（表4-2）。表4-2：miR172和GmTOE4a克隆引物Table4-2PrimersformiR172andGmTOE4afull-lengthisolation引物名称引物序列PrimerNamePrimerSequence（5’-3’）miR172a-FGCTCTAGATGCCCACTTGTTGAGGTTAG(XbaⅠ)miR172a-RGCGAGCTCGAGAGTGAACAGTATGCTAC(SacⅠ)miR172c-FGCTCTAGAACTAAAGAAATCAGTCACTG(XbaⅠ)miR172c-RGCGAGCTCTCCTCAAGCAATATCTGGTA(SacⅠ)GmTOE4a-FGCTCTAGAGAAGAAGATTAAGCGCGATG(XbaⅠ)GmTOE4a-RGCGAGCTCACCGATCCCTAAATCATGCA(SacⅠ)（四）TA克隆载体的构建1.PCR扩增反应反应体系：cDNA/DNA2μl10×KODbuffer2μldNTPMix(2mMeach)2μlMgSO4(25mM)1.2μlPrimer-F(10μM)0.6μlPrimer-R(10μM)0.6μlKOD-Plus-Neo0.5μlddH2O补足体积TotalVolume20μl51 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究反应条件：TemperatureTimeCycles94ºC5min198ºC10s56ºC30s3568ºC1min68ºC5min12.PCR产物纯化（Axygen琼脂糖凝胶回收试剂盒）（1）在紫外灯下切下目的DNA条带，用纸巾吸尽凝胶表明液体并切碎，放入2.0ml离心管，计算凝胶重量；（2）加入3个凝胶体积的BufferDE-A(凝胶熔化剂)，75ºC水浴熔化凝胶；（3）加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B(结合液)。当分离的DNA片段小于400bp时加1个凝胶体积的异丙醇；（4）将上一步混合液转移至吸附柱中，12,000×g离心1min，弃滤液；（5）加500μlBufferW1(洗涤液)，12,000×g离心1min，弃滤液；（6）加700μlBufferW2(去盐液)，12,000×g离心1min，弃滤液。以同样的方法再洗一次；（7）将吸附柱置回空收集管中，12,000×g离心2min；（8）取出吸附柱置于洁净的1.5ml离心管，在膜中央加30l65ºC预热的ddH2O，室温放置2min，12,000×g离心1min洗脱DNA。将所得溶液代替无菌水，重新洗脱一次；（9）对回收产物测浓度以及电泳检测。3.目的片段加A反应反应体系如下，72ºC保温30min，完成加A尾过程。PCR产物90ng10×Buffer1μldATPMix(2.5mM)1μl52 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究rTaq0.2μlddH2O补足体积TotalVolume10μl4.目的片段与克隆载体连接反应体系如下，16ºC金属浴，过夜连接。新鲜PCR加A产物4μl10×LigationBuffer1μlpCRⅡvector2μlT4Ligase1μlddH2O补足体积TotalVolume10μl5.大肠杆菌细胞的转化（1）取50μl冰浴上融化的感受态细胞，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴放置30min；（2）42ºC水浴热激30s，然后迅速冰浴2min，该过程不要摇动离心管；（3）加入500lLB液体培养基(不含抗生素)，37ºC200rpm培养60min，使细菌复苏；（4）吸取100μl菌液均匀涂布在Amp抗性的LB琼脂培养基(事先涂X-Gal/IPTG)上；（5）平板于37ºC倒置培养10-12h后用于蓝、白斑筛选。6.菌落PCR鉴定阳性克隆在平板上用灭菌牙签挑取10-12个白斑，分别接种到如下反应体系中进行PCR扩增，用于鉴定阳性克隆。10×Buffer2μldNTPMix(2.5mM)1μlrTaq0.2μl53 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究Primer-F(10μM)0.5μlPrimer-R(10μM)0.5μlddH2O补足体积TotalVolume20μl反应条件：TemperatureTimeCycles95ºC5min195ºC30s56ºC30s3072ºC1min40s72ºC7min17.质粒提取(Axygen质粒提取试剂盒)（1）挑取单菌落于5ml含有相应抗生素的LB培养液体基中，置于37ºC摇床上160rpm过夜培养；（2）取2ml菌液，12,000×g离心1min，弃上清；（3）加250μlBufferS1(细菌悬浮液)，涡旋震荡悬浮细菌沉淀；（4）加250μlBufferS2(细菌裂解液)，温和的上下翻转4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min；（5）加350μlBufferS3(中和液)，温和的上下翻转6-8次，12,000×g离心10min；（6）将上一步所得上清液转移至吸附柱中，12,000×g离心1min，弃滤液；（7）加500μlBufferW1(洗涤液)，12,000×g离心1min，弃滤液；（8）加700μlBufferW2(去盐液)，12,000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再洗涤一次，弃滤液；（9）将吸附柱放回离心管中，12,000×g离心1min；（10）将吸附柱移入新的1.5ml离心管中，在膜中央加60-80μl65ºC预热的ddH2O，室温静置1min。12,000×g离心1min，可用滤液再重新洗脱一次；（11）提取后的质粒测浓度、琼脂糖凝胶电泳检测后可置于-20ºC短期保存。54 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究8.克隆载体的酶切鉴定酶切体系如下，T载体上有两个BstXⅠ位点，45ºC恒温水浴过夜，反应结束后进行凝胶电泳。质粒DNA600ng10×HBuffer1μlBstXⅠ0.6μlddH2O补足体积TotalVolume10μl9.测序及序列比对（1）经过菌落PCR和酶切鉴定正确的质粒3-5个送公司测序；（2）测序结果用BioEdit软件与Phytozome数据库预测的序列进行比对。（五）植物表达载体的构建1.将测序正确的质粒用XbaⅠ和SacⅠ双酶切，琼脂糖凝胶回收带有粘性末端的目的片段2.用XbaⅠ和SacⅠ双酶切植物表达载体pTF101.1，37ºC过夜，琼脂糖凝胶回收载体片段，反应体系如下：pTF101.1质粒DNA400ng10×MBuffer2μlXbaⅠ0.4μlSacⅠ0.4μlddH2O补足体积TotalVolume20μl3.连接载体片段和目的基因片段，16ºC金属浴过夜其连接，反应体系如下：目的基因片段6μlpTF101.1载体2μl10×LigationBuffer1μlT4Ligase1μlTotalVolume10μl55 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究4.转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR和酶切验证5.质粒提取6.热激法转化农杆菌EHA101（1）取出感受态细胞在冰上融化；（2）将0.5-1μl重组质粒，加入到100μl农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30min；（3）再转移至液氮中5min，然后迅速放入37ºC水浴中5min；（4）加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，28ºC摇床150rmp轻摇4-5h；（5）12,000rmp离心1min，弃掉大部分上清，重新悬浮，取100μl涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上，28ºC倒置培养38-40h；（6）待菌落长出后，挑取6-10个进行菌落PCR检测分析。（六）大豆的遗传转化（根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化法）1.种子消毒挑选无病害、无裂痕、表面光滑、饱满的受试品种Williams82种子置于培养皿里，放入干燥器中，打开皿盖。在干燥器中放入装有NaClO的烧杯（每100mlNaClO加4mL浓HCl），进行Cl2过夜消毒12-16小时。2.种子发芽在超净工作台中，将消毒后的种子种脐向下接种于发芽培养基上，不封口，放入培养间培养5天（16h光照/8h黑暗，24ºC）。3.农杆菌的准备在YEP固体培养基上挑取农杆菌单克隆，接种于5ml含相应抗生素的YEP液体培养基中，28ºC，250rpm摇床过夜培养至菌液达到饱和。取4×1ml菌液加入4×50ml含相应抗生素的YEP液体培养基中，28ºC，250rpm培养至对数生长期（OD600=0.3-0.6）。分别向50ml离心管中分装40ml菌液，常温，3500rpm离心10min。用CCM液体培养基悬浮农杆菌沉淀，用于侵染大豆外植体。56 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究4.侵染与共培养（1）种子发芽5天后，切取发芽良好的外植体，用镊子小心剥去种皮，保留3-5mm下胚轴，沿下胚轴竖直切开两片子叶，剥离胚芽，将切下的外植体置于菌液中，沿子叶节处向下平行用手术刀轻划8-10次；（2）处理过的子叶置于菌液中侵染30min，期间轻轻晃动几次；（3）倒净菌液，用滤纸吸取残余菌液。将子叶内面向下平放在表面附有灭菌滤纸的共培养培养基中进行培养，用Parafilm封口膜封口，置于培养箱中（16h光照/8h黑暗，24ºC）共培养5天。5.芽诱导（1）共培养后，用无菌水清洗3次，再以芽诱导液体培养基（含抑菌抗生素Timentin、头孢和羧苄）清洗共培养后的外植体，清洗3次，浸泡30min，期间轻轻晃动几次；（2）倒尽液体，用滤纸吸除表面多余液体培养基，将子叶内面向上倾斜45度角插入无筛选剂的芽诱导培养基中，每皿5-7个外植体，置于培养箱中（16h光照/8h黑暗，24ºC）培养2周；（3）将外植体取出，用刀片除去真芽，保留丛生芽，在下胚轴包埋面下方进行切面处理，露出新鲜的组织。将外植体插入含8-10mg/L草丁膦的芽诱导培养基中，每皿5-7个外植体，置于培养箱中（16h光照/8h黑暗，24ºC）培养2周。6.芽伸长选取分化良好的外植体，去除死芽和大芽，在下胚轴包埋面下方进行切面处理，露出新鲜的组织。将外植体插入含4-5mg/L草丁膦的芽伸长培养基中，每瓶2-3个外植体，置于培养箱中（16h光照/8h黑暗，24ºC）培养，每2周继代一次，继代5-6次。7.生根当芽伸长时期中的再生芽达到2-3cm时，进行生根处理，将伸长芽切下转入生根培养基，置于培养箱中（16h光照/8h黑暗，24ºC）诱导生根。57 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究8.再生苗移栽当再生苗产生足够的根，取出洗掉琼脂，移栽至土壤：蛭石（1:1）的营养钵中，用塑料杯将营养钵和苗盖住，以保持湿度，待其生长良好时转入大盆中。（七）大豆转基因后代的鉴定1.除草剂的抗性检测对于大豆转基因植株载体上的Bar基因进行检测，在转基因植株及其后代的新生幼嫩叶片用毛笔涂抹草丁膦（160mg/L），并用marker笔在叶片上标记，3-7天后观察抗性表型。2.分子检测对于通过除草剂初筛获得抗性的植株，取叶片提取RNA，通过Real-timePCR方法检测目的基因的表达。（八）大豆转基因后代的表型观察对于获得的大豆转基因阳性植株从T1代开始观察表型。从大豆出土见光开始进行光照处理，长日照（LD，16h光照/8h黑暗），短日照（SD，12h光照/12h黑暗）。观察植株形态并记录花期，花期的计算是从大豆出土进行光照处理开始到第一朵花开放为止的一段时间，至少要观察5株以上取平均值。第二节结果与分析一、大豆miR172和GmTOE4a基因的克隆（一）大豆miR172的克隆以大豆品种Harosoy基因组DNA为模板，根据miRNA数据库miRBasehttp://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?org=gma中大豆miR172a和miR172c前体茎环序列，并结合大豆全基因组序列，克隆miR172a和miR172c的前体骨架。PCR扩增产物与理论上的长度一致（图4-1），回收带有58 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究XbaⅠ/ScaⅠ酶切位点的PCR产物，连接至pTF101.1植物表达载体上，获得过表达载体pTF101.1-pre-miR172a和pTF101.1-pre-miR172c。经过菌落PCR验证（图4-2）、HindⅢ/SacⅠ双酶切鉴定（图4-3）和测序，结果均与预期一致，证明pTF101.1-pre-miR172a/c质粒构建正确，可用于大豆的遗传转化。图4-1PCR扩增大豆pre-miR172cFig.4-1Amplificationofpre-miR172cbyPCRM：核酸分子量标准DS2000；1-4：扩增结果M：MarkerDS2000；Lane1-4：PCRamplificationproduct图4-2重组载体pTF101.1-pre-miR172c转化大肠杆菌PCR鉴定结果Fig.4-2PCRcertificationresultsoftransformingE.coliwithpTF101.1-pre-miR172cM：核酸分子量标准DS2000；1-14：扩增结果；15：阳性对照；16：阴性对照（模板为水）M：MarkerDS2000；Lane1-14：PCRamplificationproductoftransformingE.coliwithpTF101.1-pre-miR172c；Lane15：positivecontrolwithDNAastemplate；Lane16：negativecontrolwithdistilldeionizedwaterastemplate59 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究图4-3重组载体pTF101.1-pre-miR172c的双酶切鉴定Fig.4-3DoubledigestionofvectorpTF101.1-pre-miR172cwithendonucleasesHindⅢ/SacⅠM：Trans2KPlusⅡDNAMarker；1-4：重组质粒的HindⅢ/SacⅠ双酶切M：Trans2KPlusⅡDNAMarker；1-4：DoubledigestionofrecombinedplasmidswithendonucleasesHindⅢ/SacⅠ（二）大豆miR172靶基因GmTOE4a的克隆根据大豆基因组数据库http://www.phytozome.net/soybean公布的GmTOE4a基因（Glyma15g04930）转录序列，设计特异性引物。以短日照条件（12h光照/12h黑暗）处理大豆品种Harosoy的总RNA反转录获得的cDNA为模板，PCR扩增得到约1.5kb的单一特异条带（图4-4），结果与预期大小一致。将该片段连入克隆载体pCRⅡ-Tvector，获得pCRⅡ-GmTOE4a质粒，转化大肠杆菌后经蓝白斑筛选、菌落PCR（图4-5）和BstXⅠ酶切鉴定（图4-6），将鉴定正确的阳性克隆送交Invitrogen公司测序，测序结果使用BioEdit软件进行比对，得到序列完全正确的T载体克隆。植物表达载体pTF101.1构建图谱如图4-7所示，用XbaⅠ/SacⅠ分别双酶切表达载体pTF101.1和质粒pCRⅡ-GmTOE4a，分别回收大、小片段，通过T4DNA连接酶连接后转化农杆菌感受态细胞EHA101，重组表达载体经菌落PCR（图4-8）和HindⅢ双酶切鉴定（图4-9），结果表明插入片段大小与位置完全正确，可用于大豆的遗传转化。60 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究图4-4PCR扩增GmTOE4a基因Fig.4-4AmplificationofGmTOE4agenebyPCRM：核酸分子量标准DS2000；1：扩增结果M：MarkerDS2000；Lane1：PCRamplificationproduct图4-5载体pCRⅡ-GmTOE4a转化大肠杆菌PCR鉴定结果Fig.4-5PCRcertificationresultsoftransformingE.coliwithpCRⅡ-GmTOE4aM：核酸分子量标准DS2000；1-14：扩增结果；15：阳性对照；16：阴性对照（模板为水）M：MarkerDS2000；Lane1-14：PCRamplificationproductoftransformingE.coliwithpCRⅡ-GmTOE4a；Lane15：positivecontrolwithcDNAastemplate；Lane16：negativecontrolwithdistilldeionizedwaterastemplate图4-6重组克隆载体pCRⅡ-GmTOE4a的酶切鉴定Fig.4-6DigestionofvectorpCRⅡ-GmTOE4awithendonucleasesBstXⅠM：Trans2KPlusⅡDNAMarker；1-3：BstXⅠ双酶切重组质粒M：Trans2KPlusⅡDNAMarker；Lane1-3：DigestionofrecombinedplasmidswithendonucleasesBstXⅠ注：BstXⅠ起到双酶切的作用61 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究图4-7pTF101.1-GFP质粒图谱Fig.4-7SchematicdiagramofvectorpTF101.1-GFP图4-8植物表达载体pTF101.1-GmTOE4a转化农杆菌EHA101的PCR鉴定结果Fig.4-8PCRcertificationresultsoftransformingEHA101withpTF101.1-GmTOE4aM：核酸分子量标准DS2000；1-14：扩增结果；15：阳性对照16：阴性对照（模板为水）M：MarkerDS2000；Lane1-14：PCRamplificationproductoftransformingE.coliwithpTF101.1-GmTOE4a；Lane15：positivecontrolwithpCRⅡ-GmTOE4aastemplate；Lane16：negativecontrolwithdistilldeionizedwaterastemplate图4-9植物表达载体pTF101.1-GmTOE4a的酶切鉴定Fig.4-9DigestionofvectorvectorpTF101.1-GmTOE4awithendonucleasesHindⅢM：Trans2KPlusⅡDNAMarker；1-4：HindⅢ双酶切重组质粒M：Trans2KPlusⅡDNAMarker；1-4：DigestionofrecombinedplasmidswithHindⅢ注：HindⅢ起到双酶切的作用62 中国科学院大学博士学位论文：miR172及其靶基因在大豆光周期调控开花中的功能研究二、大豆转基因植株的鉴定与获得（一）除草剂的抗性检测对获得的T0代大豆转基因植株进行除草剂草丁膦（160mg/L）抗性鉴定（图4-10A），除草剂涂抹以后叶片仍为绿色的大豆植株为转基因阳性事件，选取此阳性事件进行繁殖，得到的T1代植株继续进行除草剂的抗性鉴定，同时提取叶片基因组DNA，进行Bar基因检测（图4-10B）。PCR扩增Bar基因的检测结果与除草剂的涂抹结果一致，表明在获得的转基因后代中有Bar基因序列的插入并表达，初步证明带有Bar筛选基因的植物过表达载体插入大豆基因组中。图4-10转基因大豆的草丁膦抗性检测Fig.4-10DetectionoftransgenicsoybeanplantsA：转基因大豆后代除草剂草丁膦的涂抹检测结果。红色箭头所示为除草剂涂抹部位，叶片保持绿色为转基因阳性植株，叶片变黄枯萎为转基因阴性植株。B：转基因大豆后代Bar基因的PCR检测；1：野生型Williams82；2：阴性对照（叶片涂抹变黄）；3-6：转基因阳性植株；M：核酸分子量标准DS2000A:LeafpaintingoftransgenicsoybeanplantsusingtheherbicideGlufosinate.Theredarrowsindicateherbicidepaintingarea.Witheredleavesindicatenegativetransformants.B:PCRanalysisoftheBargeneintransgenicsoybeanplants.1,Wild-typeWilliams82;2,Negativecontrol(negativetransgenicplants);3-6,Positivetransgenicplants;M,DS2000marker（二）分子检测对于T1代的35S::miR172c和35S::GmTOE4a阳性大豆转基因植株，提取叶片和生长点的总RNA，分别进行相应基因的分子检测。Real-timePCR的63 第四章大豆miR172及其靶基因的功能研究检测结果表明在转基因植株的叶片和生长点中miR172c和GmTOE4a的表达均显著高于野生型Williams82（图4-11），尤其miR172c在35S::miR172c转基因叶片中的表达量是野生型的63倍，GmTOE4a在35S::GmTOE4a转基因顶端分生组织中的表达量是野生型的52倍。进一步证明了35S::miR172c和35S::GmTOE4a转基因株系分别成功导入了miR172c和GmTOE4a基因。图4-11miR172c和GmTOE4a转基因大豆的Real-timePCR检测Fig.4-11DetectionofmiR172candGmTOE4atransgenicsoybeanplantsintheleavesandshootapicesbyReal-timePCR显著性分析采用T检验，*0.01