淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响及相关机制探讨

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分类号：___________密级:__________UDC:___________淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响及相关机制探讨ThePathologicalImpactofIcariinonDementiaModelMiceandRelatedMechanism姓名：王晗学号：2111348181院系：中药学院专业：中药学研究方向：中药活性成分研究与新药研发导师姓名：李国营（教授）校外导师：李虹（副主任医师）论文提交日期：2016年3月论文答辩日期：2016年5月学位授予单位：广东药科大学二○一六年五月 广东药科大学硕士学位论文目录摘要.........................................................................................................................................IThePathologicalImpactofIcariinonDementiaModelMiceandRelatedMechanism.....III1.前言.....................................................................................................................................12.材料与方法.........................................................................................................................52.1实验材料......................................................................................................................52.1.1主要仪器与试剂....................................................................................................52.2实验动物.....................................................................................................................82.3实验方法......................................................................................................................82.3.1动物模型的建立及给药.......................................................................................82.3.2动物的取材...........................................................................................................92.3.3组织形态学检测....................................................................................................92.3.4蛋白质印迹检测.................................................................................................112.3.5酶联免疫吸附实验（Elisa）.............................................................................122.3.6超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒检测..............................................................122.3.7谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒检测..............................................122.3.8图像分析及统计学方法.....................................................................................13结果......................................................................................................................................143.1淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响........................................................143.1.1HE结果...............................................................................................................143.1.2Elisa结果.............................................................................................................153.1.3SOD和GSH-PX试剂盒检测结果....................................................................183.1.4免疫组化结果.....................................................................................................19 广东药科大学硕士学位论文3.1.5WesternBlot结果...............................................................................................233.2相关机制探讨结果....................................................................................................253.2.1免疫组化结果......................................................................................................263.2.2WesternBlot结果...............................................................................................27讨论......................................................................................................................................294.1老年痴呆动物模型的建立........................................................................................294.2淫羊藿苷作用与Aβ的变化.....................................................................................294.3淫羊藿苷作用与tau蛋白和CDK5的变化.............................................................304.5淫羊藿苷作用与AChE和ChAT的变化................................................................314.6淫羊藿苷作用与SOD和GSH-PX的变化..............................................................314.7PGEN变化与相关机制探讨.....................................................................................324.8总结及后续工作........................................................................................................32结论......................................................................................................................................34参考文献..............................................................................................................................35中英文缩写语对照表..........................................................................................................43攻读学位期间发表的文章..................................................................................................44致谢......................................................................................................................................45 广东药科大学硕士学位论文摘要老年痴呆（AD）是一种原发性、不可逆转的、伴有认知障碍和记忆丧失的神经系统退行性疾病，病因迄今未明。“Aβ学说”是最为普遍接受的AD发病学说，即β-淀粉样蛋白（Aβ）是AD发病的最主要原因，其在大脑内特定区域聚集，引发一系列病理变化（神经元死亡、神经纤维缠结、氧化应激以及胆碱能系统损伤。最近几年研究发现颗粒蛋白（PGRN）与AD和Aβ之间有着密切关系。PGRN与Aβ存在某种数量关系，参与了AD的一系列病生理过程，但是PGRN在AD发病中的具体机制还不清楚。淫羊藿苷（ICA）为小檗科淫羊属植物淫羊藿的主要有效成分，其药理作用研究较多的是生殖和内分泌方面。今年来，ICA在神经系统方面的作用越来越受到人们的重视，已经取得了一定得的研究成果，而其对AD的治疗作用研究还比较少。本实验用Aβ1-42诱导小鼠AD模型，ICA给药处理，观察ICA对Aβ沉积、神经纤维缠结、氧化应激和胆碱能系统损伤等AD典型病理特征的影响，而且探讨了PGRN在小鼠海马中的数量变化，为后续进一步研究ICA对AD的治疗作用以及PGRN在AD发病中的机制打下基础。方法：将小鼠分为四大组，分别为对照组（Naive）、生理盐水组（NS）、模型组（Aβ）和治疗组，其中治疗组又分三个小组，分别为ICA30、60和120mg/kg组。模型组和治疗组小鼠双侧海马内注射寡聚态Aβ1-42构造老年痴呆模型，生理盐水组用等量生理盐水替代，对照组不做处理。造模次日起，治疗组ICA30、60和120mg/kg灌胃给药，其它组用等量生理盐水替代，连续14天后取材。HE染色，观察小鼠海马形态学变化。Elisa检测小鼠海马内Aβ1-42、AChE和ChAT的含量。免疫组织化学法检测小鼠海马内Aβ1-42的沉积以及tau蛋白、CDK5和PGRN的表达。试剂盒检测小鼠海马内SOD、GSH-PX和NOS的含量。Westernblot检测tau蛋白、CDK5和OGRN的表达。I 广东药科大学硕士学位论文结果：1.淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响（1）HE结果：与对照组和生理盐水组相比，模型组小鼠海马炎症损伤明显，神经元变性，细胞皱缩，胞体与周围组织脱离，细胞核固缩，治疗组有所改善。（2）Elisa结果：模型组Aβ1-42含量明显增多，而对照组和生理盐水组几乎检测不到Aβ1-42的沉积，治疗组与模型组相比Aβ1-42含量有所下降。模型组与对照组和生理盐水组相比AChE和ChAT含量明显下降，治疗组有所升高。（3）SOD和GSH-PX试剂盒检测结果：模型组与对照组和生理盐水组相比SOD和GSH-PX含量明显下降，治疗组有所升高。（4）免疫组织化学结果：各组都观察不到明显的Aβ1-42。（5）Westernblot结果：模型组与对照组和生理盐水组相比tau蛋白和CDK5含量明显升高，治疗组有所下降。2.相关机制探讨结果（1）免疫组织化学结果：模型组与对照组和生理盐水组相比PGRN含量明显升高，治疗组有所下降。（2）Westernblot结果：模型组与对照组和生理盐水组相比PGRN含量明显升高，治疗组有所下降。结论：1.Aβ1-42可以诱导小鼠海马内产生一系列老年痴呆病理特征（神经纤维缠结、产生氧化应激、胆碱能系统损伤）。2.淫羊藿苷治疗可减轻AD模型鼠的类AD病理，且有剂量依赖性，这种对AD病理的改善作用可能是通过加快Aβ的清除，抑制tau磷酸化，提高乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱转移酶的活性，降低氧化应激反应实现的。3.Aβ沉积可致PGRN表达量增加，淫羊藿苷治疗可显著降低PGRN的表达，且有剂量依赖性，提示PGRN可能与AD的病理有关，这为AD发病机理提供了一条新的思路。关键词：老年痴呆；淫羊藿苷；病理学；Aβ1-42；PGRNII 广东药科大学硕士学位论文ThePathologicalImpactofIcariinonDementiaModelMiceandRelatedMechanismHanWang(HumanAnatomyandHisto-embryology)Supervisor:Prof.GuoyingLi[Abstract]Alzheimer’sdisease(AD)isakindofnervoussystemdegenerativediseasewiththefeaturesofhidingonsetandprogressivedevelopment,andetiologyisunknownyet.“Aβtheory”themostwidelyacceptedtheoryofAlzheimer’sdisease(AD),Accordingtothisexplanation,amyloid-βprotein(Aβ)isthemostmainreasonofAlzheimer’sdisease(AD).AggregationofAβintheparticularareaofthebraincanleadtoaseriesofpathologicalchanges(Deathofneurons,Neurofibrillarytangles,OxidativestressandDamageofcholinergicsystem).Inrecentyears,studieshavefoundthatprogranulin(PGRN)havecloserelationshipswithADandAβ.ThereissomequantitativerelationbetweenPGRNandAβ,whichisinvolvedinaseriesofphysiologicalprocessesofAD,butthespecificmechanismofPGRNinthepathogenesisofADisstillunclear.Icariin(ICA)isthemainactiveingredientoftheBerberidaceaeEpimediumgenusEpimediumplantsandthemajorpharmacologivaleffectsofICAreproductiveandendocrine.Inrecentyears,moreandmoreattentionhasbeenpaidtotheroleofICAinthenervoussystem,whichhasobtainedacertainresearchresults,anditseffectonthetreatmentofADisstillrelativelyfewer.Inthisstudy,weusedAβ1-42toinduceADmicemodelandICAtotreatthemouse.Then,weobservedtheimpactofICAonAβdeposition,Neuraltangles,OxidativestressandDamageofcholinergicsystem,whicharethetypicalfeaturesofADpathologyanddiscussedthequantityvariationofPGRNinmousehippocampus.ThisstudylayedafoundationforfurtherstudyoftheeffectofICAonADtreatmentandthemechanismofPGRNinADpathogenesis.Methods:Miceweredividedintofourgroups,includingcontrolgroup(Naive),normalIII 广东药科大学硕士学位论文salinegroup(NS),modelgroup(Aβ)andthetreatmentgroup,thetreatmentgroupwasdividedintothreegroups,respectivelyICA30,60and120mg/kggroups.ThemodelgroupandtreatmentgroupmicebilateralhippocampalinjectionofoligomericstateAβ1-42indementiamodel,withamountofnormalsalineinsteadofphysiologicalsalinegroup,controlgroupdon'tdoprocessing.Modelingthenextday,thetreatmentgroup,ICA30,60and120mg/kggavage,theothergroupwithalternativeequivalentphysiologicalsaline,materialsfor14consecutivedays.HEstaining,observethechangesofhippocampalmorphologyinmice.ElisatestmicehippocampuswithinAβ1-42,AChEandChATcontent.ThehippocampusinmiceweretestedbyimmunohistochemicalmethodinAβ1-42depositionandtheexpressionoftauprotein,PGRNandCDK5.ThecontentsofSOD,GSH-PXandNOSinhippocampusofmiceinthetestkit.Westernblotdetecttheexpressionoftauprotein,CDK5andOGRN.Results:EffectsofICAonthepathologyofAlzheimer'sdiseasemodelmiceTheresultsofHE：Comparedwiththecontrolgroupandsalinegroup,modelgroupmicehippocampusinflammatoryinjuryobviously,neuronaldegenerationandcellshrinkage,cellbodiesandthesurroundingtissuefrom,thenucleuspycnosis,treatmentgroupwasimproved.TheresultsofElisa：Aβ1-42contentofmodelgroupwasobviouslyincreased,andthecontrolgroupandsalinegroupalmostundetectableAβ1-42deposition,thetreatmentgroupcomparedwithmodelgroupAβ1-42contentdeclined.ModelgroupcomparedwithcontrolgroupandsalinegroupAChEandChATcontentdecreasedobviously,thetreatmentgroupwasincreased.TheresultsofSODandgsh-pxkittest:ModelgroupcomparedwithcontrolgroupandsalinegroupcontentofSODandgsh-pxdecreasedobviously,thetreatmentgroupwasincreased.TheresultsofImmunohistochemical:GroupsareobservenoobviousAβ1-42.TheresultsofWesternblot:ModelgroupcomparedwithcontrolgroupandsalineIV 广东药科大学硕士学位论文grouptauproteinandCDK5contentincreasedsignificantly,thetreatmentgroupdeclined.Relatedmechanisms（1）TheresultsofImmunohistochemical:ModelgroupcomparedwithcontrolgroupandsalinegroupPGRNcontentincreasedsignificantly,thetreatmentgroupdeclined.（2）TheresultsofWesternblot:ModelgroupcomparedwithcontrolgroupandsalinegroupPGRNcontentincreasedsignificantly,thetreatmentgroupdeclined.Conclusions:1.Aβ1-42caninduceaseriesofpathologicalfeaturesofAlzheimer'sdisease(nervefiberentanglement,oxidativestress,cholinergicsystemdamage)inthehippocampusofmice.2.IcariintreatmentcanreducetheADmodelmicepathologywithdosedependent.Thisimprovementmayberealizedthroughacceleratingtheclearanceofamyloidbeta,inhibitingtauphosphorylation,enhancingtheactivityofacetylcholinesteraseandcholineacetyltransferaseanddecreasingoxidativestressreaction.3.AbetadepositioncanincreasedtheexpressionofPGRN,IcariintreatmentcansignificantlyreducetheexpressionofPGRNwithdosedependent,thisstudysuggeststhatPGRNmayberelatedtothepathologyofAD,whichprovidesanewwayofthinkingforthepathogenesisofAD.Keywords：Alzheimer’sDisease;Icariin;Pathology;ProgranulinV 广东药科大学硕士学位论文1.前言老年痴呆（AD）是一种起病隐匿、进行性发展的、伴有认知障碍和记忆丧[1]失的神经退行性疾病。人口老龄化的进展使AD发病率逐渐增高，已经成为一个严重的社会问题，第六次全国人口普查显示，60岁及以上人口AD所占比例[2][3]为13.26%。近几年调查显示65岁人群AD发病率为1%-2%，85岁为35%。2050年，我国65岁以上人口将会占到总人口的35%，AD发病率会更高，给老[4,5]年人和社会带来沉重负担。老年斑（SP）的沉积，神经元纤维缠结（NFT）和神经元丢失是AD的主要[6]病理特征，好发区域是与学习和记忆相关的区域—海马区和大脑皮质区。此外，[7-9]AD的显著病理特征还有氧化应激的产生和胆碱能系统的损伤。AD病因不明，研究人员先后提出很多种学说，其中Aβ学说最被人普遍接受，其主要内容是β-淀粉样蛋白（Aβ）是造成AD的最主要原因，Aβ的聚集引发相应的神经毒性，突触损伤，神经元死亡，导致AD患者记忆衰退和认知功能[10]障碍。研究显示Aβ是健康人体液的正常组成成分，大多以结合态存在，少数[11-12]以游离态存在。老年斑是由Aβ沉积形成，Aβ学说认为，聚集态的Aβ是导致AD病变的最主要原因，是引起ＡＤ其他病理改变的关键环节，Aβ1-40和Aβ1-42是Aβ的两种主要亚型，细胞中产生Aβ1-40的量远多于Aβ1-42，但是Aβ1-42较Aβ1-40有更高的毒性，更易聚积形成淀粉样蛋白，是老年斑的主要成[13]分，由此说明，Aβ1-42的沉积改变在AD的发病机制中占有更重要的作用。神经纤维缠结（NFT）是AD的另一主要病理特征，研究表明NFT主要与[14]Tau蛋白过度磷酸化相关。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，在神经元中广泛[15-16]分布，主要生理功能是参与微管形成和调节神经元轴突物质运输，在AD发生过程中，Tau蛋白受各种因素的影响导致过度磷酸化，失去了维持微管正常[17]形态与功能的能力，造成神经元的损伤和纤维缠结，过度磷酸化的Tau蛋白[18]也会对正常的微管功能造成影响。因此过度磷酸化的Tau蛋白与AD直接相[19]关。tau蛋白的过度磷酸化受多种蛋白激酶活性的影响，CDK5就是主要的一种，CDK5可催化神经元中包括tau蛋白在内的各种微管相关蛋白的磷酸化，[20]CDK5的过度活化或表达与tau蛋白的过度磷酸化直接相关。1 广东药科大学硕士学位论文[21]神经变性疾病往往和氧化应激有关，老年痴呆也不例外。氧化应激是指当机体产生的自由基超出自身抗氧化系统的清除能力时所出现的一种病理生理状态。大量研究证实氧化应激是Aβ毒性的决定因素，Aβ可促进氧自由基产生，[22]引起线粒体功能障碍，产生氧化应激，导致神经细胞死亡。超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是机体重要的氧自由基清除酶。研究表明SOD与组织细胞抗氧化损伤、机体清除自由基有关，GSH-Px可清除自[23-24]由基和减少脂质过氧化物的形成。老年痴呆与中枢胆碱能系统也有着密切的关系，胆碱能系统与学习和记忆有[25]关。大脑皮质、海马受损会导致胆碱能缺陷，胆碱能神经通路受损，记忆、计算、理解等功能障碍。AD患者脑组织胆碱能缺陷，乙酰胆碱酯酶（AChE）[26]和乙酰胆碱转移酶（ChAT）活性下降。针对AD的上述病理特征，人们研制出治疗老年痴呆的许多药物，如针对Aβ学说的药物Aβ形成抑制剂、APP抑制剂等（《在研抗阿尔茨海默病药物》），针对tau蛋白学说的药物亚甲蓝、罗丹宁等，针对胆碱能学说的药物他克林、多奈哌齐等。上述药物治疗老年痴呆有一定疗效，但都有一定的局限性，治疗效果并不是很理想或者还处在试验阶段。近几年，许多治疗老年痴呆的新型疗法应运[27][28]而生，如干细胞疗法、基因治疗等，这些疗法具有很好的前景，然而，许多技术目前还处在研究阶段，而且存在投入高，花费大的缺点。中医药在改善AD方面有独特优势，笔者发现，治疗老年痴呆的经典处方中基本都含有淫羊藿，淫羊藿为小檗科淫羊属植物，其主要活性成分为淫羊藿苷（ICA），现代研究发现淫羊藿苷具有抗抑郁、改善缺血性脑损伤、抗痴呆、抗[29-30]衰老等作用。以往对ICA研究主要集中在生殖和内分泌方面，近年来，淫羊藿苷与神经系统疾病关系的研究逐渐增多，主要有以下两大方面研究：（1）[31]抗氧化应激，清除自由基。自由基常常与机体氧化应激有关，所以延缓衰老[32]就要抗氧化应激，清除或减少过多的自由基。HE等对快速老化小鼠（SAMP8）给予ICA治疗，发现ICA可以降低脑匀浆和血清MDA、NO含量，抑制NOS活性，增加SOD、GSH-PX活性。MDA、NO、NOS、SOD和GSH-PX等与氧化应激密切相关，这说明ICA在清除脑组织中自由基方面有重要作用。龚其海[33]等用染铝诱导大鼠学习记忆障碍模型，然后用ICA干预，相较模型组，中、2 广东药科大学硕士学位论文高剂量（分别为60、120mg/kg）ICA灌胃对大鼠氧化应激有明显改善作用，大鼠海马内SOD活性明显升高，MDA含量降低。[34]（2）保护神经系统，改善认知障碍。URANO等发现ICA可以改善AD[35]转基因小鼠的记忆减退。李娌等对大鼠侧脑室注射Aβ25-35诱导老年痴呆模型，然后给予ICA干预，发现给药组大鼠行为学指标明显改善，认知障碍减轻。[36]金凤等的研究“淫羊藿苷通过抑制TNF-α，IL-6和caspase3的表达改善Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病大鼠空间学习记忆能力”表明ICA可以改善大鼠的学习记忆能力，减轻认知障碍。神经变性疾病一直是医学难题，相关机制不明确是多数疾病无法根治，预后不良的最主要原因。近年来，由于分子生物学的发展，人们对神经变形疾病的病因及发病机制有了更加深入的了解，研究发现，PGRN基因突变和小胶质细胞激[37-39]活是多种神经变性疾病的共同特点之一。PGRN是一种在多种组织中表达的多功能生长因子，参与许多生理和病理进程，包括细胞增殖、创伤修复、炎症调[40-42]节等。PGRN存在于人体大量组织和器官中，主要是上皮组织，中枢神经系统中，PGRN主要在神经元和小胶质细胞中表达，而星形胶质细胞和少突胶质细[43][44]胞中不表达。之前，人们对PGRN在神经系统中的作用知之甚少。自从PGRN基因多态性发现以来，PGRN在大脑中作用的研究迅速增多。PGRN基因突变与多种神经变性疾病密切相关，已被证实的有FTD（包括Pick病、额叶痴呆、原[45-48][49][50-52][53-54]发性进行性失语等），AD，多发性硬化（MS）和缺血性脑血管病等。PGRN与AD相关性的研究越来越受到人们的关注，研究表明，PGRN参与了AD一系列病理过程，包括Aβ沉积和清除、tau蛋白磷酸化、神经炎症和神[55-57][58]经元存活，PGRN在AD中可能起到了神经保护作用。Minami等研究发现，PGRN能抑制Aβ沉积。选择性减少PGRN在转基因AD小鼠小胶质细胞中的表达，可以使淀粉样斑块沉积增加三倍，并且加重小鼠认知障碍；慢病毒介导的PGRN过表达，减少AD小鼠斑块沉积，Aβ沉积与海马中PGRN水平呈负相关，表明PGRN对于斑块沉积有剂量依赖性关系，实验同时发现PGRN能减轻Aβ毒性和空间记忆障碍，减少海马神经元损失。另有研究发现，在转基因AD[59]小鼠中，Aβ斑块周围小胶质细胞PGRN表达增高。随后的临床试验发现，PGRN[60]基因突变导致AD患者血清PGRN明显低于该基因正常人群。有研究发现，3 广东药科大学硕士学位论文AD、PGRN和肿瘤三者之间也有关联，AD患者癌症发病风险比同龄人群低，癌症患者AD发病风险也比同龄人群低，具体机制不明确，AD患者低水平PGRN[49]可能降低了肿瘤的发病，肿瘤患者高水平PGRN可能降低了AD的发病。相信随着科学的发展，对PGRN的深入研究能够为AD的发病机制和治疗提供新的思路。本研究用Aβ1-42诱导小鼠AD模型，ICA灌胃处理，观察ICA对AD小鼠一系列病理学指标—Aβ的沉积、NFT（tau蛋白和CDK5）、自由基清除（SOD和GSH-PX）和胆碱能损伤（AChE和ChAT）的影响。ICA对神经系统疾病有较好疗效，但其对老年痴呆影响的研究目前还不是很多，本实验比较全面系统的研究了ICA对Aβ诱导的AD小鼠典型病理特征的影响，从基础研究的角度探讨ICA对AD的影响，对相应的应用研究具有重要参考价值和指导意义。同时，本研究以PGRN作为AD相关病理机制的研究具有一定的创新意义，是对两者关系研究的一点补充，为后续研究提供依据和参考。4 广东药科大学硕士学位论文2.材料与方法2.1实验材料2.1.1主要仪器与试剂2.1.1.1仪器仪器厂家ST-3ND型脑立体定位仪成都仪器厂KDSModel310Plus微量进样泵美国KDScientificSYW-3万向微推进器成都仪器厂78001型颅钻STRONG/Korea25μL平头微孔进样器上海高鸽工贸有限公司JA2003A电子天平上海精天电子仪器厂CX-21生物显微镜日本OLYMPUSTS-1摇床海门其林贝尔仪器制造有限公司KD23B-DA微波炉美的集团S22-2恒温磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司ES1520电炉广州轻出集团有限公司HH-1数显恒温水浴锅浙江省金坛市宏华仪器厂LX-100手掌型离心机海门其林贝尔仪器制造有限公司Thermo移液器赛默飞世尔（上海）仪器有限公司YCD-EL259电冰箱中科美菱低温科技有限责任公司GSP-9160MBE隔水式恒温培养箱上海博迅实业有限公司UPR-11-5T超纯水器成都超纯科技有限公司超低温冰箱中科美菱低温科技有限责任公司PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂TDL-5台式离心机上海安亭科学仪器厂GPD观片灯北京京东医疗仪器有限公司YD-12P脱水机浙江省金华市益迪医疗设备厂YD-6L包埋机浙江省金华市益迪医疗设备厂5 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广东药科大学硕士学位论文苏木精上海阿拉丁试剂丽春红上海阿拉丁试剂2.2实验动物SPF级C57雄性小鼠100只，7周龄，体重20-25g，购于广东省医学实验动物中心，许可证号：2013-0002。在SPF级环境中饲养一周后，进行动物模型制备。实验动物分为6组，分别为对照组（Naive），生理盐水组（NS），模型组（Aβ）和淫羊藿苷（ICA）30、60、120mg/kg组（Aβ+ICA30、60、120mg/kg），每组16只。对照组（Naive）：小鼠没有经历任何的手术或给药处理；生理盐水组（NS）：小鼠双侧海马注射生理盐水；模型组（Aβ）：小鼠双侧海马注射Aβ1-42；淫羊藿苷组（ICA）：小鼠双侧海马注射Aβ1-42后分别给予ICA30、60和120mg/kg灌胃处理。2.3实验方法2.3.1动物模型的建立及给药2.3.1.1Aβ1-42的孵育把Aβ1-42冷冻干粉（购于AnaSpec，0.5mg）溶解于100μL1%氨水中，制成浓度为5μg/μL的储备液，混匀、分装后置于-20℃保存。用时加入无菌生理盐水稀释至2μg/μL，置37℃恒温培养箱中孵育24小时以上，使其成为寡聚态Aβ。2.3.1.2动物模型的制备小鼠手术前经4%水合氯醛进行麻醉，每10g体重0.15ml，腹腔注射。麻醉成功后，将C57小鼠头顶去毛，用75%酒精消毒，然后将小鼠置于脑立体定位仪上进行固定。手术刀沿正中矢状方向划开一个切口，暴露头骨，找到前囟位置，做好标记，参照小鼠脑立体定位图谱，于前囟后3mm，左右旁开2.3mm处打孔。微量进样器自颅骨表面垂直进针2.5mm，每侧海马注射样品2μL，进样速度0.8μL/min。模型组和淫羊藿苷组注射寡聚态Aβ1-42，浓度为2μg/μL，对照组注射等量无菌生理盐水。注射后，留针2min，后缓慢退针。缝合伤口后，按4万8 广东药科大学硕士学位论文单位/只给予青霉素钠肌注，后每天一次，大约2-3天。整个过程无菌操作。2.3.1.3给药处理（1）淫羊藿苷溶液的配置根据各组小鼠体重按照30、60和120mg/kg灌胃剂量称取淫羊藿苷干粉，然后加入一定量生理盐水制成混悬液。（2）小鼠淫羊藿苷灌胃术后次日，淫羊藿苷组小鼠按照30、60和120mg/kg剂量给予淫羊藿苷灌胃处理，连续14天，其余各组小鼠用等量生理盐水代替。2.3.2动物的取材给药后14天取材，每组小鼠分两批取材，每批随机挑选8只，第一批用于后续组织形态学检测，第二批用于后续蛋白质印记、Elisa和试剂盒检测，第一批取材步骤如下：用4%水合氯醛麻醉小鼠，断头处死后，小心剥离颅骨取脑，存于4%多聚甲醛中固定。第二批取材步骤如下：按步骤1取脑后迅速剥离出海马，放入预冷的冻存管中，迅速存于-80℃冰箱。2.3.3组织形态学检测2.3.3.1组织的包埋和切片多聚甲醛中固定48小时后，取出脑组织，冠状面修切平面至海马区，做好标签，置脱水瓶中，冲水约4小时。然后置于全自动生物组织脱水机中，脱水、透明和浸蜡。组织脱水时间设定：70%酒精，15.5h→80%酒精，7.5h→90%酒精，6h→95%酒精Ⅰ，4h→95%酒精Ⅱ，4h→100%酒精Ⅰ，3h→100%酒精Ⅱ，2h→二甲苯Ⅰ，1h→二甲苯Ⅱ，1h→低熔点蜡（48-50℃），0.5h→中熔点蜡（53℃-56℃），1h→高熔点蜡（60-62℃），2h；组织包埋：提前预热自动包埋机，将已融化的高熔点蜡倒入包埋框，然后将浸蜡完的组织放入其中，放正，切面朝下，贴好标签。等到石蜡全部凝固后，推掉蜡块；切片：切取大脑海马结构（包含注射部位），切片厚度为6μm，每隔60μm取一张片，构成一套切片。切片放入40-45℃水中展开，捞片后晾干，放在玻片架上，于37℃恒温箱中烤片5h。9 广东药科大学硕士学位论文2.3.3.2苏木素-伊红染色（HE）脱蜡至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ，95%、90%、80%、70%、50%酒精各5min，双蒸水洗3次；苏木素染色：Mayer’sHematoxylin20min；蓝化：流水冲洗返蓝20min，双蒸水洗3次；脱水：50%、70%、80%、90%酒精各2min；伊红复染：1%伊红7s；洗涤：95%酒精Ⅰ、Ⅱ；脱水透明：100%酒精Ⅰ、Ⅱ，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min；中性树胶封片，显微镜下观察拍照。2.3.3.3免疫组织化学检测（HRP法）脱蜡至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ，95%、90%、80%、70%、50%酒精各5min，双蒸水洗3次；抗原修复：置0.01M柠檬酸缓冲液中微波修复20min，自然冷却到室温，双蒸水洗3次；阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温30min，PBS洗3x5min；封闭：10%BSA封闭液封闭，湿盒内，37℃，30min，倾去勿洗；滴加一抗：一抗有Rabbitanti-Aβ1-42，1：100，Rabbitanti-tau（S202）1：500，Rabbitanti-CDK5，1：500，Sheepanti-PGRN，1：500，阴性对照滴加PBS，4℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗3x5min；滴加HRP标记二抗：二抗为HRP-Goatanti-rabbitIgG,HRP-Donkeyanti-sheepIgG，37℃孵育40min，PBS洗4x5min；DAB显色：约2min，镜检，双蒸水冲洗，终止染色；苏木素复染：1-2min，冲水返蓝1-2min，镜检观察至最佳染色效果，双蒸水冲洗；脱水、透明、封片：50%、70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精各5min脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min透明，中性树胶封片；显微镜下观察图像并拍照。注：各种蛋白免疫组化实验至少重复3次。10 广东药科大学硕士学位论文2.3.4蛋白质印迹检测2.3.4.1蛋白质的提取将冻存的海马组织分别转移到预冷的匀浆器中，加入含有1mM蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA（强）裂解液500μL，冰上匀浆，充分裂解，冰冻离心机12000rmp离心5min，取上清，即为蛋白溶液，标记分装，-80℃保存。2.3.4.2蛋白质定量用BCA蛋白定量测定试剂盒测定所提蛋白浓度。准备96孔板，按每个样品加三个孔做好标记。按照说明书要求配置BCA试剂A和B混合液，加入待测孔中，待测样品用RIPA裂解液稀释200倍，根据说明书将待测样品和标准品加入待测孔中，放入酶标仪中震荡20s，然后37℃孵育30min，用酶标仪测定570nm的OD值。根据OD值-标准品浓度绘制标准曲线，计算待测样品浓度。注：每孔一批实验各做3孔，实验至少重复3次。2.3.4.3WesternBlotSDS-PAGE电泳：按每孔上样蛋白量40μg，计算各个样品所需体积，用RIPA裂解液补足20μL，与5xloadingbuffer5μL混匀，100℃热变性处理5min。将制好的胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，加入5μLmarker，其余孔中分别加入热处理后的样品20μL，吹打气泡。然后按浓缩胶80V恒压，分离胶120V恒压进行电泳。转膜：待溴酚蓝刚跑出时终止电泳，进行转膜处理。一般用300mA恒流，转移2h（根据目标蛋白分子量大小确定）。转完膜后丽春红染色5min，观察条带；封闭：将膜移至5%脱脂奶粉封闭液中，室温下摇床上封闭1h；孵一抗：将膜加入对应一抗（Rabbitanti-tau（S202）1：500；Rabbitanti-CDK5，1：500；Sheepanti-PGRN，1：500）中4℃孵育过夜。TBST洗3x10min；孵二抗：将膜加入相应二抗（HRP-Goatanti-rabbitIgG，HRP-Donkeyanti-sheepIgG）室温孵育1h。TBST洗3x20min；化学发光、显影和定影：将ECL发光液加到pvdf膜上，反应2min，完成后，将膜移至保鲜膜上，去尽残液，包好后置于胶片暗盒中（蛋白面朝上）。暗室中，曝光、显影、水洗、定影。自来水冲洗，室温晾干。11 广东药科大学硕士学位论文注：所有样本WesternBlot实验重复至少3次。2.3.5酶联免疫吸附实验（Elisa）1.标准品的稀释：按照说明书要求进行标准品稀释；2.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。加入准备好的样品（2.3.4.1中提取的蛋白样品）和标准品，37℃反应30min；3.洗板：将浓缩洗涤液稀释，加入孔中，静置后弃去，重复5次；4.加酶：洗板后除空白孔外每孔加入酶标试剂，37℃反应30min；5.洗板：操作同3；6.显色：洗板后，加入显色液A、B，37℃避光显色10min；7.终止：加入终止液，终止反应；8.测定：空白孔调零，450nm波长测量各孔吸光度（OD值）；9.计算：以标准物浓度-OD值绘制标准曲线，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注：每孔一批实验各做3孔，所有样本Elisa实验重复至少三次以上。2.3.6超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒检测1.工作液配置：按照说明书要求配置所需工作液；2.加样：分别设对照孔、对照空白孔、测定孔、测定空白孔。加入准备好的样品（2.3.4.1中提取的蛋白样品）和工作液，37℃孵育20分钟；3.测定：波长450nm，酶标仪测定OD值；4.计算：根据说明书计算公式算出SOD活力。注：每孔一批实验各做3孔，所有样本试剂盒检测重复至少三次。2.3.7谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒检测1.工作液配置：按照说明书要求配置所需工作液；2.酶促反应：设置酶管和非酶管。加入准备好的样品（2.3.4.1中提取的蛋白样品）和工作液，混匀，4000rpm离心10min，取上清作显色反应；3.显色反应：设置空白管、标准管、非酶管、酶管。加入2中的上清和所需工作液，混匀，室温静置15min，双蒸水调零，波长412nm测定各管OD值；4.计算：根据说明书公式计算GSH-PX活力。注：每孔一批实验各做3孔，所有样本试剂盒检测重复至少三次。12 广东药科大学硕士学位论文2.3.8图像分析及统计学方法WesternBlot实验图片用Imagepro-plus6.0图像分析系统软件计算光密度值，用于统计学分析。实验数据采用X±S表示，用GraphpadPrism6统计分析软件对数据进行单因素方差分析，P<0.05，结果有统计学意义。13 广东药科大学硕士学位论文结果3.1淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响有前言可知，老年痴呆有5大典型病理特征，本实验通过Aβ1-42诱导小鼠老年痴呆模型，淫羊藿苷灌胃，观察淫羊藿苷对老年痴呆模型小鼠的病理学影响。3.1.1HE染色本实验用寡聚态Aβ1-42注射到C57小鼠海马区诱导小鼠AD模型，Aβ的注射的成功与否是本实验成败的关键。由图1HE结果可以看到，本次实验造模是成功的，生理盐水组（NS）、模型组（Aβ）、治疗组（Aβ+ICA30、60、120mg/kg）小鼠海马齿状回部位可以看到明显的注射损伤区域。其中，模型组损伤最为明显，区域明显扩大，注射部位周围神经元变性，细胞核固缩，胞体与周围组织脱离，治疗组有所改善。这说明淫羊藿苷对神经元有一定保护作用，可以减轻Aβ1-42沉积引起的神经元变性和损伤14 广东药科大学硕士学位论文图1.海马HEA.对照组（Naive）；B.生理盐水组（NS）；C.模型组（Aβ）；D.治疗组ICA30mg/kg（Aβ+ICA30mg/kg）；E.治疗组ICA60mg/kg（Aβ+ICA60mg/kg）；F.治疗组ICA120mg/kg（Aβ+ICA120mg/kg）。A1、B1、C1、D1、E1、F1分别为A、B、C、D、E、F的放大图。ScaleBar：100μm.3.1.2Elisa结果3.1.2.1AβElisa结果本实验用酶联免疫吸附测定检测海马中Aβ的含量，检测结果如表1。图2为柱状分析图。与Naïve组相比，NS组海马Aβ含量无显著性差异，Aβ和治疗组海马Aβ含量明显减少，结果有显著性差异（P＜0.01）；与Aβ组相比，治疗组海马Aβ含量明显减少，结果有显著性差异（P＜0.01）；与治疗组ICA30mg/kg组相比，治疗组ICA60、120mg/kg海马Aβ含量明显减少，结果有显著性差异（P＜0.01）。结果表明，淫羊藿苷可以加快Aβ的清除。表1小鼠海马中Aβ含量值（μg/L，X±S）组别NaiveNSAβAβ+ICA30mg/kgAβ+ICA60mg/kgAβ+ICA120mg/kgAβ含量0.30±0.00.28±0.024.1±0.319.0±0.315.1±0.314.3±0.415 广东药科大学硕士学位论文图2小鼠海马Aβ含量Elisa检测定量分析各组与Naïve组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗组与Aβ组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；Aβ+ICA60、120mg/kg组与Aβ+ICA30mg/kg组相比，+P＜0.05，++P＜0.01。3.1.2.2AChE和ChATElisa结果老年痴呆常伴有中枢胆碱能系统的损伤，乙酰胆碱酯酶（AChE）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）是胆碱能系统两种重要的酶，检测海马中这两种酶的含量可以反映中枢胆碱能系统状况。表2为小鼠海马AChE和ChAT含量，图3是数据分析图。与Naïve组相比，NS组海马AChE和ChAT含量无显著性差异，Aβ和治疗组海马AChE和ChAT含量明显减少，结果有显著性差异，其中Aβ和治疗组ICA30mg/kgP＜0.05，治疗组60、120mg/kg组P＜0.01；与Aβ组相比，治疗组海马AChE和ChAT含量明显增高，结果有显著性差异，其中治疗组ICA30mg/kgP＜0.05，治疗组60、120mg/kg组P＜0.01；与治疗组ICA30mg/kg组相比，ICA60、120mg/kg组海马AChE和ChAT含量明显增高，结果有显著性差异（P＜0.01）。这说明淫羊藿苷可以提高AChE和ChAT活性，减轻胆碱能系统损伤。16 广东药科大学硕士学位论文表2小鼠海马AChE和ChAT含量值（U/mL，X±S）GroupAChEChATNaive79.5±0.873.1±0.7NS75.4±1.072.1±1.1Aβ45.0±0.751.3±0.9Aβ+ICA30mg/kg50.8±0.454.0±1.9Aβ+ICA60mg/kg68.7±0.564.5±0.9Aβ+ICA120mg/kg70.6±0.367.2±0.8图3小鼠海马AChE和ChAT含量定量分析A.AChE含量定量分析图；B.ChAT含量定量分析图。各组与Naïve组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；治疗组与Aβ组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；Aβ+ICA60、120mg/kg组与Aβ+ICA30mg/kg相比，+P＜0.05，17 广东药科大学硕士学位论文++P＜0.01。3.1.3SOD和GSH-PX试剂盒检测结果老年痴呆能使机体发生氧化应激，产生过多的自由基，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是两种重要的自由基清除酶，因此检测这两种酶的含量，可以反映自由基清除情况。表3是小鼠海马SOD和GSH-PX含量，图4是数据分析图。SOD柱状分析结果显示，与Naïve组相比，NS组和治疗组ICA60、120mg/kg小鼠海马中SOD含量变化无显著性差异，Aβ组和治疗组ICA30mg/kg小鼠海马SOD含量明显降低，结果有显著性差异，（分别为P＜0.01、P＜0.05）；与Aβ组相比，治疗组海马SOD含量明显增高，结果有显著性差异（P＜0.01）；与治疗组ICA30mg/kg相比，治疗组ICA60、120mg/kg海马SOD含量明显升高，结果有显著性差异（P＜0.05）。GSH-PX柱状分析结果显示，与Naïve组相比，NS组海马GSH-PX含量无显著性差异，Aβ和治疗组海马GSH-PX含量明显降低，结果有显著性差异，其中，Aβ组和治疗组ICA30、60mg/kgP＜0.01，治疗组ICA120mg/kgP<0.05；与Aβ组相比，治疗组海马GSH-PX含量明显升高，结果有显著性差异（P＜0.01）；与治疗组ICA30mg/kg相比，治疗组ICA60、120mg/kg海马GSH-PX含量明显升高，结果有显著性差异（分别为P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，淫羊藿苷可以通过提高SOD和GSH-PX活性降低氧化应激反应。表3小鼠海马SOD和GSH-PX含量值(KU/g，X±S)GroupSODGSH-PXNaive150.9±3.242.0±0.6NS144.1±2.841.1±0.8Aβ52.3±1.35.5±0.4Aβ+ICA30mg/kg134.8±3.426.8±0.6Aβ+ICA60mg/kg145.1±0.933.4±0.4Aβ+ICA120mg/kg146.1±1.737.4±1.018 广东药科大学硕士学位论文图4小鼠海马SOD和GSH-PX含量定量分析A.SOD含量定量分析图；B.GSH-PX含量定量分析图。各组与Naïve组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；治疗组与Aβ组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；Aβ+ICA60、120mg/kg组与Aβ+ICA30mg/kg相比，+P＜0.05，++P＜0.01。3.1.4免疫组化结果3.1.4.1Aβ1-42免疫组化结果向C57小鼠海马注射寡聚态Aβ1-42后，会引起Aβ在海马内的沉积，用免疫组织化学方法可以检测Aβ的沉积状况。如图5所示，本次实验各组小鼠海马均观察不到明显的Aβ沉积，可能是随着时间的推移，Aβ发生了降解、清除或者转移。19 广东药科大学硕士学位论文图5海马Aβ沉积免疫组化A.对照组（Naive）；B.生理盐水组（NS）；C.模型组（Aβ）；D.治疗组ICA30mg/kg（Aβ+ICA30mg/kg）；E.治疗组ICA60mg/kg（Aβ+ICA60mg/kg）；F.治疗组ICA120mg/kg（Aβ+ICA120mg/kg）。A1、B1、C1、D1、E1、F1、分别为A、B、C、D、E、F、的放大图。20 广东药科大学硕士学位论文3.1.4.2tau蛋白免疫组化结果老年痴呆的主要病理特征之一就是海马内神经纤维缠结（NFT），而神经纤维缠结与tau蛋白过度磷酸化密切相关，因此，检测tau蛋白在海马内的表达对于了解神经纤维缠结状况是必要的。由图6可知，模型组（Aβ）海马中tau蛋白含量明显高于对照组（Naive）和生理盐水组（NS），治疗组（Aβ+ICA30、60、120mg/kg）有所下降，但仍旧有较高含量。这表明Aβ1-42使小鼠海马磷酸化tau蛋白增加，淫羊藿苷可以减少磷酸化tau蛋白表达，进而减轻神经纤维缠结。21 广东药科大学硕士学位论文图6海马tau蛋白表达免疫组化A.对照组（Naive）；B.生理盐水组（NS）；C.模型组（Aβ）；D.治疗组ICA30mg/kg组（Aβ+ICA30mg/kg）；E.治疗组ICA60mg/kg组（Aβ+ICA60mg/kg）；F.治疗组ICA120mg/kg组（Aβ+ICA120mg/kg）。A1、B1、C1、D1、E1、F1分别为A、B、C、D、E、F的放大图。3.1.4.3CDK5免疫组化结果CDK5是细胞周期素依赖性蛋白激酶5，其表达过多，能促进tau蛋白过度磷酸化。因此，检测小鼠海马CDK5含量，可以反应tau蛋白磷酸化情况，从而进一步反应神经纤维缠结状况，再次验证3.1.4.2的结果。图7显示，模型组（Aβ）海马中CDK5蛋白含量明显高于对照组（Naive）和生理盐水组（NS），治疗组（Aβ+ICA30、60、120mg/kg）有所下降，但仍旧有较高含量，和3.1.4.2结果相对应。结果显示，Aβ1-42可以使小鼠海马CDK5显著增加，而淫羊藿苷可以减少CDK5表达，减轻tau蛋白磷酸化。22 广东药科大学硕士学位论文图7海马CDK5表达免疫组化A.对照组（Naive）；B.生理盐水组（NS）；C.模型组（Aβ）；D.治疗组ICA30mg/kg（Aβ+ICA30mg/kg）；E.治疗组ICA60mg/kg（Aβ+ICA60mg/kg）；F.治疗组ICA120mg/kg（Aβ+ICA120mg/kg）。A1、B1、C1、D1、E1、F1分别为A、B、C、D、E、F的放大图。3.1.5WesternBlot结果23 广东药科大学硕士学位论文3.1.5.1tau蛋白WesternBlot结果由图8可知，与Naïve组相比，NS组海马tau蛋白含量无显著性差异，Aβ和治疗组海马tau蛋白含量明显增高，结果有显著性差异（P＜0.01）；与Aβ组相比，治疗组海马tau蛋白含量明显下降，结果有显著性差异（分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.01）；与治疗组ICA30mg/kg想比，治疗组ICA60、120mg/kg海马tau蛋白含量明低，结果有显著性差异（P＜0.01），验证了免疫组化结果。图8tau蛋白在小鼠海马中的表达A.tau蛋白Westernblot；B.tau蛋白含量定量分析。各组与Naïve组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；治疗组与Aβ组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；Aβ+ICA60、120mg/kg组与Aβ+ICA30mg/kg相比，+P＜0.05，++P＜0.01。3.1.5.2CDK5WesternBlot结果24 广东药科大学硕士学位论文由图9可知，与Naïve组相比，NS组海马CDK5含量无显著性差异，Aβ和治疗组海马CDK5含量明显增高，结果有显著性差异（P＜0.01）；与Aβ组相比，治疗组海马CDK5含量明显降低，结果有显著性差异（P＜0.01）；与治疗组ICA30mg/kg相比，治疗组ICA60、120mg/kg海马CDK5含量明显减少，结果有显著性差异（分别为P＜0.05、P＜0.01），验证了免疫组化结果。图9CDK5在小鼠海马中的表达A.CDK5Westernblot；B.CDK5含量定量分析。各组与Naïve组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；治疗组与Aβ组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；Aβ+ICA60、120mg/kg组与Aβ+ICA30mg/kg相比，+P＜0.05，++P＜0.01。3.2相关机制探讨结果有前言可知，PGRN与老年痴呆和Aβ沉积有密切关系，PGRN可能参与AD病理进程，本研究通过Aβ1-42诱导小鼠老年痴呆模型，淫羊藿苷灌胃处理，25 广东药科大学硕士学位论文通过观察PGRN表达变化为揭示老年痴呆发病机理提供了一条新的思路。3.2.1免疫组化结果图10显示，Aβ组海马PGRN含量明显高于Naïve和NS组，治疗组有所下降。结果表明，Aβ1-42沉积可致PGRN表达量增加，淫羊藿苷可显著降低PGRN的表达。26 广东药科大学硕士学位论文图10PGRN免疫组化A.对照组（Naive）；B.生理盐水组（NS）；C.模型组（Aβ）；D.治疗组ICA30mg/kg（Aβ+ICA30mg/kg）；E.治疗组ICA60mg/kg（Aβ+ICA60mg/kg）；F.治疗组ICA120mg/kg组（Aβ+ICA120mg/kg）。A1、B1、C1、D1、E1、F1分别为A、B、C、D、E、F的放大图。3.2.2WesternBlot结果由图11可知，与Naïve组相比，NS组海马PGRN含量无显著性差异，Aβ和治疗组海马PGRN含量明显增高，结果有显著性差异（P＜0.01；与Aβ组相比，治疗组ICA30mg/kg海马PGRN含量无显著性差异，治疗组ICA60、120mg/kg海马PGRN含量明显减少，结果有显著性差异（P＜0.01）；与治疗组ICA30mg/kg组相比，治疗组60、120mg/kg海马PGRN含量明显减少，结果有显著性差异（P＜0.01），验证了免疫组化的结果。27 广东药科大学硕士学位论文图11PGRN在小鼠海马中的表达A.PGRNWesternblot；B.PGRN含量定量分析。各组与Naïve组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；治疗组与Aβ组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；Aβ+ICA60、120mg/kg组与Aβ+ICA30mg/kg相比，+P＜0.05，++P＜0.01。28 广东药科大学硕士学位论文讨论本研究用Aβ1-42诱导小鼠AD模型，ICA灌胃处理，观察ICA对AD模型小鼠如下病理学指标—Aβ沉积、神经纤维缠结（tau蛋白和CDK5）、自由基清除（SOD和GSH-PX）和胆碱能损伤（AChE和ChAT）的影响。从基础研究的角度探讨ICA对AD的影响，对临床的相关药物开发和神经退行性疾病治疗具有重要参考价值和指导意义。此外，本研究对PGRN和AD的数量联系做了一些补充，为揭示AD发病机理提供了一条新的思路。4.1老年痴呆动物模型的建立本实验用Aβ1-42诱导了小鼠AD模型，造模成功是后续实验成功的关键。目前老年痴呆的动物模型主要有以下几种：（1）D-半乳糖致痴呆动物模型。这[61,62]种模型被国内学者广泛应用，常联合亚硝酸钠或氯化铝腹腔注射。优点是经济易行、模拟损伤全面，缺点是周期长、外界干扰因素多。（2）胆碱能损伤致痴呆模型。此种模型较好地模拟了胆碱能系统损伤的特征，但是对AD主要病理特征呈现不足。（3）快速老化动物模型。快速老化小鼠最初是在普通小鼠表型[63][64]选择中培育出来的。近年，有学者用此模型研究老年神经退行性疾病。此种模型价格昂贵、寿命短，不宜用作长期实验（4）转基因动物模型。随着分子生物学和基因工程的发展，转基因动物在AD中的应用越来越广泛，已经取得了[65,66]非常可观的成果。这是目前最接近AD的动物模型，尽管在技术上有许多困难，但相信随着研究的深入，转基因动物模型技术会日趋完善。（5）Aβ诱导痴呆动物模型。这是目前应用非常广泛，能够较好模拟AD病理特征的模型，缺点是对AD某些病理特征的呈现仍有不足。随着科技大发展及研究的不断深入，转基因与复合动物模型会逐渐成为趋势。鉴于本实验室现有条件，Aβ诱导动物AD模型是最合适的方法，而且此种方法也较好的呈现了AD主要病理特征。4.2淫羊藿苷作用与Aβ的变化本实验用Aβ1-42注射小鼠海马部位，成功模拟了AD的主要病理特征。HE29 广东药科大学硕士学位论文结果显示注射部位可以看到明显的针孔和损伤区域，Aβ1-42能引起注射部位周围神经元变性，细胞核固缩，胞体与周围组织脱离，ICA可以改善神经元损伤和变性状况。Aβ1-42免疫组化各个组都观察不到明显的Aβ沉积，AβElisa结果显示尽管Aβ和治疗组小鼠海马中Aβ含量明显高于Naive和NS组，但是其数值依然很低，这说明，Aβ可能在海马中发生了清除、降解或者转移。Aβ的减少会不会减缓AD的病理进程，Aβ与AD有没有一个精确的量效关系，我们还不清楚。这也是一直困扰研究者的难题。Aβ的沉积可能只是一种触发因素，后期Aβ[67]被清除也不能阻止病变的进程。有研究表明，免疫治疗患者脑内Aβ含量明显[68]低于未治疗的AD患者，但是其认知功能并没有逆转，仍会持续到痴呆晚期。相信随着人们对AD的不断认识，AD与Aβ的量效关系终究会有定论。4.3淫羊藿苷作用与tau蛋白和CDK5的变化本实验结果显示，Aβ组磷酸化tau蛋白（Ser202tau蛋白）和CDK5明显高于Naive和NS组，治疗组有所下降，但含量仍然很高，这说明注射Aβ1-42能引起磷酸化tau蛋白和CDK5明显升高，从而引起NFT，而淫羊藿苷可以减轻NFT。神经纤维缠结（NFT）是AD两大主要病理特征之一，NFT主要与两大蛋白质密切相关—tau蛋白和CDK5。tau蛋白是神经系统蛋白，其过度磷酸化是NFT形成过程中早期细胞骨架改变之一。一般情况下，tau蛋白有2-3个磷酸基团修饰，其磷酸化和去磷酸化保持动态平衡，维持细胞骨架的稳定。AD病理状[69]况下，tau蛋白能连接9-10个磷酸基团，导致其过度磷酸化，形成NFT。高度磷酸化tau蛋白失去原有功能，不能促进微管聚集和维持细胞骨架稳定。而且，高度磷酸化tau蛋白与正常tau蛋白竞争结合微管，导致游离的高度磷酸化tau[70]蛋白增加，而正常tau蛋白减少。tau蛋白高度磷酸化受多种酶的调控，CDK5就是其中主要的一个。有研究表明，CDK5与神经退行性疾病密切相关，CDK5[71]长期过表达导致细胞死亡。在AD病理过程中，Aβ代谢异常和tau蛋白过度磷酸化之外，CDK5表达量也明显升高，其加重tau蛋白过度磷酸化，首先，CDK5可直接磷酸化tau蛋白，另外，通过调控作用tau蛋白的磷酸酶或激酶起作用，[72]tau蛋白容易被磷酸化的位点有Ser202、Ser235、Ser199、Ser404和Thr205。Aβ和tau蛋白哪个是AD的源头一直是科学界争论的话题，尽管每个学说都有30 广东药科大学硕士学位论文一定的实验依据，但都不能完全解释AD的发病机制，Aβ与tau蛋白联合作用机制将成为新的研究方向。4.5淫羊藿苷作用与AChE和ChAT的变化本实验用Elisa检测小鼠海马AChE和ChAT含量值，结果显示Aβ组这两种酶含量明显低于Naive和NS组，治疗组有所生高，说明Aβ1-42能引起海马AChE和ChAT含量显著减少，从而导致胆碱能系统损伤，ICA作用能使胆碱能系统有所恢复。乙酰胆碱酯酶（AChE）能使神经递质乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，乙酰胆碱转移酶（ChAT）将乙酰辅酶A转移到胆碱上，导致乙酰胆碱的形成。AChE和ChAT是脑内胆碱能系统的重要标志酶，其减少引起胆碱能递质紊乱，这是引起认知功能障碍的原因之一。越来越多的研究证实脑内胆碱能系统损伤参与AD的病理进程，海马胆碱能系统损伤和胆碱能神经元丢失是AD的主要病理特征，而乙酰胆碱减少是导致学习记忆能力下降的直接原因。研究者发现[73]AD患者胆碱能系统损伤好发部位为与认知、学习有关的海马、新皮层等。胆碱能系统损伤也常常作为AD的发病机制来探讨，还有与之对应的AD动物模型，但是此种机制解释与论证与Aβ和tau蛋白学说相比还有一定差距，相信随着科学的发展，AD与胆碱能系统更深层次的关系终会被人们所知。4.6淫羊藿苷作用与SOD和GSH-PX的变化本实验结果显示，Aβ组小鼠海马SOD和GSH-PX含量明显低于Naive和NS组，这表明，Aβ可能引起小鼠氧化应激的产生，生成过多自由基，或者Aβ使SOD和GSH-PX活性降低。治疗组小鼠海马中这两种酶含量显著升高，说明ICA对恢复小鼠抗氧化系统的平衡有一定作用。AD会使机体产生氧化应激，正常情况下，机体自由基的产生和清除维持动态平衡，而氧化应激可打破这种平衡，使体内产生过多自由基，对细胞造成损伤。机体有抗氧化系统，超氧化物歧化酶（SOD）就是一种非常重要的抗氧化酶，它通过歧化反应除去超氧离子，维持机体自由基平衡，使细胞免受损伤。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是另一种重要的抗氧化酶，是体内主要的自由基清除剂。细胞内GSH-PX含量的降低能够[74]引起过氧化反应和细胞凋亡。因此，检测AD小鼠海马中的SOD和GSH-PX31 广东药科大学硕士学位论文含量可以间接反映氧化应激程度。一般认为自由基理论是神经退行性疾病发病机制的“交汇点”，自由基理论往往和脂质过氧化、钙离子稳态以及线粒体功能障碍[75-77]有密切联系，研究自由基有助于我们对AD的发病机制和治疗有进一步的认识。4.7PGRN变化与相关机制探讨本研究用PGRN作为机制探讨，立意是比较新颖的。AD发病机制不清楚，这一直是医学界的难题。PGRN与神经退行性疾病关联的研究越来越受到人们的重视，本实验用Aβ1-42诱导小鼠AD模型，ICA灌胃治疗来研究PGRN表达量。实验结果显示，Aβ组小鼠14天海马中Aβ沉积很少，但是PGRN含量相较Naive组和NS组明显升高，治疗组PGRN含量有所下降，且高剂量组下降明显，但与Naive和NS组比较含量依旧较高，这说明即使Aβ被清除，PGRN也可能伴随着AD的病理进程以较高含量存在，提示PGRN可能与AD病理相关，为揭示AD发病机制提供了一条新的思路，更深层次的机制将会在后续实验探讨。4.8总结及后续工作造模成功后，我们用ICA研究其对AD主要病理学的影响，通过引言介绍可以看出，虽然ICA对AD的影响已经有所研究，但是不够系统全面，而且所用的动物模型也不尽相同。本研究在查阅大量文献及细心观察的基础上，比较全面系统的研究了ICA对Aβ1-42诱导的AD小鼠经典和主要病理学影响，从基础研究的角度探讨了ICA对AD病理的改善，不足之处是缺乏行为学检测，后续实验将会补充。ICA是中药淫羊藿的主要活性成分，其作用于AD模型小鼠后，小鼠海马神经元损伤有所好转，神经纤维缠结有所减轻，清除自由基能力增强，胆碱能系统有所恢复，表明淫羊藿苷对于Aβ1-42所引发的一系列AD病理有改善作用。这提示我们ICA制剂或与其它药物联合治疗老年痴呆会有巨大潜力，中医药治疗老年痴呆必将迎来光明前景。本课题组今后研究方向：（1）Aβ减少或清除后，AD的病理状况；（2）ICA与其它药物联合治疗AD及寻求AD更为有效的治疗方法；（3）PGRN与AD更深层次的机制探讨；（4）将转基因动物应用到AD研究中。相信随着科技的32 广东药科大学硕士学位论文发展和研究的不断深入，老年痴呆的发病机制定会为人们所知，老年痴呆的治疗也将迎刃而解，本课题组将会将会一如既往地在科研道路上走下去，为AD的研究增砖添瓦。33 广东药科大学硕士学位论文结论1.Aβ1-42可以诱导小鼠海马内产生一系列老年痴呆病理特征（神经纤维缠结、产生氧化应激、胆碱能系统损伤）。2.ICA治疗可减轻AD模型鼠的类AD病理，这种对AD病理的改善作用可能是通过加快Aβ的清除，抑制tau磷酸化，提高AChE和ChAT的活性，降低氧化应激反应实现的。3.Aβ沉积可致PGRN表达量增加，ICA治疗可显著降低PGRN的表达，提示PGRN可能与AD的病理有关，这为AD发病机理提供了一条新的思路。34 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广东药科大学硕士学位论文cognitivedysfunctionandoxidativestressinducedbyAβ25-35inrats[J].MetabBrainDis,2016,23(2):1-1342 广东药科大学硕士学位论文中英文缩写语对照表Aβamyloid-ββ-淀粉样蛋白ADAlzheimer‘sDisease阿尔茨海默病（老年痴呆）ICAIcariin淫羊藿苷NSNormalsaline生理盐水IHCImmunohistochemistry免疫组织化学HEHematoxylinandEosinstainingHE染色WBWesternblot蛋白质印迹43 广东药科大学硕士学位论文攻读学位期间发表的文章[1]王晗,梁自豪,李国营,等.银杏内酯A对L-谷氨酸致HT22细胞损伤作用的研究[J].解剖学研究,2016,38(1):36-40.44 广东药科大学硕士学位论文致谢光阴似箭，三年研究生学习生涯即将结束，人生要开始一段新的旅程。通过这三年的学习和实践，我受益匪浅，明白了许多做人做事的道理，掌握了更多的科研方法，领悟了更多的科研精神。我取得的成就除了自身努力外，更与他人的帮助和关心密切相关。这里，我向他们表示最真诚的谢意。首先感谢我的导师李国营教授，李老师给了我在广东药学院继续深造的机会，开启了我丰富多彩的研究生生活。李老师在生活、学习和为人处事方面给予了我很大帮助。生活上，李老师对我关怀备至，使我无后顾之忧；学习上，李老师渊博的知识、严密的思路和求真的态度使我受益终生；为人处事上，李老师经常给我传授做人做事的道理，以自身行动给我树立了榜样。谢谢您，李老师。感谢田素民老师对我的关心和帮助，田老师和蔼可亲的面容和善良宽容的内心让我感受到了极大的温暖，您一直在默默关心着我们，给我们信心和力量。感谢广东省医学会的李虹医师，在外实践期间，李虹老师给了我很大的帮助和很好的指导。感谢刘靖和李艳萍教授对我的帮助和指导。感谢同实验室的马宇昕和罗利老师以及同学石晶、郑嵋戈、阮志刚、谭亮、孙灵芝、姚狮章、赵萌萌、梁自豪、李珊珊、张亚琼、程晓晖、李细霞、杨炳翠、范玉宝、黄维玲、杨德慧、高宁辛、赖胜敏等。特别感谢我的父母，有了你们的关心和支持，我无所畏惧，我的生活是那样美好。45