LPS通过下调ATOH8对肝癌细胞生物活性的影响及其初步机制研究

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1、温州医科大学硕士学位论文分类号：R5单位代码：10343学号：151001129硕士学位论文论文题目:LPS通过下调ATOH8对肝癌细胞生物活性的影响及其初步机制研究研究生姓名：杨敬貌学科专业：内科学（消化系统疾病）类型：学术型指导教师：程计林教授二O一八年五月温州医科大学硕士学位论文论文题目：LPS通过下调ATOH8对肝癌细胞生物活性的影响及其初步机制研究答辩委员会主席：吕宾教授浙江中医药大学附属第一医院答辩委员会成员：沈贤教授温州医科大学附属第二医院余颖聪教授温州市人民医院论文答辩日期：2018年5月30日温州医科大学硕士学位论文目录一.论文中文摘要··

2、·········································1英文摘要···········································3缩略词表···········································5前言···············································7材料与方法·········································9结果·············································

3、··21分析与讨论·········································32小结···············································34参考文献···········································36附录···············································40致谢···············································41二、综述························

4、·······················43三、独创性声明·········································53温州医科大学硕士学位论文正文LPS通过下调ATOH8对肝癌细胞生物活性的影响及其初步机制研究摘要背景目的：目前肠道菌群及其代谢产物在肝脏疾病中的作用日益受到关注，临床研究显示，肝癌患者体内存在着肠道菌群易位和内毒素（LPS）代谢紊乱现象。研究发现LPS可以影响肿瘤干细胞表面标记分子CD133以及β-catenin蛋白的表达，从而对肿瘤细胞生物学活性产生影响。前期研究中，我们发现肝癌患者体内LPS以及TLR4水平

5、的升高，同时伴有组织和外周血单核细胞CD133表达水平的升高，而CD133的表达受到转录因子ATOH8的调控，但是，目前为止，LPS、ATOH8在肠道微生态紊乱与肝癌的发生发展之间的调节作用机制尚不清楚。为此我们就LPS对肝癌细胞的作用，以及转录因子ATOH8在这一过程中起到的作用进行探讨。材料方法：1.通过流式分析比较健康者、慢性乙型肝炎患者、乙肝肝硬化患者及肝癌患者外周血单核细胞中LPS受体TLR4表达情况，并通过western-blot实验检测4种常见的肝癌细胞系TLR4表达情况，根据表达水平选择合适细胞系作为研究对象；2.采用CCK8、细胞平板克隆、

6、划痕实验检测LPS对肝癌细胞生物行为的影响，同时通过AnnexinV/PI双染法及7-AAD试剂检测LPS刺激后对肝癌细胞凋亡及周期的影响；3.Westernblot（WB）及qPCR检测LPS刺激肝癌细胞系Huh7后TLR4、ATOH8及β-catenin表达水平的变化；同时用siRNA干扰ATOH8后，观察β-catenin表达变化；4.构建ATOH8过表达体系细胞，通过细胞平板克隆、划痕实验及裸鼠致瘤实验检测ATOH8对肝癌细胞生物学行为的影响；5.流式检测ATOH8过表达后干细胞标记分子CD133的表达水平，同时检测在LPS刺激下其表达水平的变化。1

7、温州医科大学硕士学位论文结果：1.肝病组患者外周血PBMC中TLR4蛋白表达阳性率普遍更高，其中乙肝肝癌组患者最高，其余依次为乙肝肝硬化组>慢性乙型肝炎组>健康对照组。TLR4受体在4种肝癌细胞系中均有不同程度的表达，SMMC7721细胞系TLR4表达水平最高，其次为Huh7及MHCC97H细胞，HepG2细胞TLR4表达最低；2.CCK8试剂检测结果显示当LPS浓度为100ng/ml时，LPS对细胞的促进增长作用最强；在LPS刺激作用下，肝癌细胞集落形成增多，迁移能力增强；凋亡实验结果显示LPS刺激后，肝癌细胞凋亡相应减少，而细胞周期的检测结果提示LPS刺

8、激后S期（DNA合成期）比例增加；3.LPS体外刺激