肺泡化阻滞的新机制lps通过抑制csk活性影响肌成纤维细胞的极性

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1、上海交通大学医学院硕士学位论文肺泡化阻滞的新机制:LPS通过抑制CSK活性影响肌成纤维细胞的极性Thenewmechanismofalveolararrestinneonatalrats：LPSaffectsporlarizationofmyofibroblastthroughinhibitingtheactivityofCSK作者姓名：何华指导教师：张拥军学科专业：儿科学答辩日期：2013年5月10日研究生学号：1107229343关键词：支气管肺发育不良；脂多糖；绒毛膜羊膜炎；抗体芯片；CSK；细胞迁移；茶碱二零一三年五月I

2、万方数据上海交通大学医学院硕士学位论文肺泡化阻滞的新机制:LPS通过抑制CSK活性影响肌成纤维细胞的极性作者姓名：何华指导老师：张拥军导师组成员：钱继红主任医师谢丽娟副主任医师夏红萍主治医师学科专业：儿科学研究方向：新生儿肺损伤的机制研究申请学位：硕士答辩日期：2013年5月10日培养单位：上海交通大学医学院附属新华医院二零一三年五月II万方数据上海交通大学医学院硕士学位论文III万方数据上海交通大学医学院硕士学位论文IV万方数据上海交通大学医学院硕士学位论文肺泡化阻滞的新机制:LPS通过抑制CSK活性影响肌成纤维细胞的极性摘要

3、目的：支气管肺发育不良（bronchopulmonarydysplasia,BPD）是早产儿中最常见的慢性肺部疾病。在胎龄小于30周的早产儿中发病率可达到20%-30%，而重症患儿的死亡率可达30%-40%。BPD是导致早产儿患病和死亡的常见病因，同时也是婴儿期慢性呼吸系统疾病和神经发育落后的重要病因。近年来随着早产儿重症监护技术的提高，提出了“新型BPD”的概念，其主要病理表现为：次级分隔缩短、肺泡数目减少、体积增大及结构简单化等。流行病学资料显示，胎儿的未成熟肺暴露于宫内炎性环境中，是早产儿出生后发生BPD的重要危险因素。羊

4、膜腔注射LPS造成新生鼠肺组织肺泡结构简单化，是模拟BPD病理改变的经典模型。我们通过建立新生鼠动物模型，来探讨LPS导致新生鼠肺泡化阻滞病理改变的分子机制，同时探索茶碱对LPS导致新生鼠肺泡化阻滞病理过程能否起到保护作用。方法：第一部分：选择孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS或等体积生理盐水，待其自然分娩。实验分为LPS组和生理盐水（saline）组。取第七天新生鼠左上肺组织做HE染色病理切片并进行形态学分析。各组随机选取4个右肺组织融合，各做一张细胞因子抗体芯片；第二部分：抗体芯片结果提示LPS上调了一系列细胞迁移相关因

5、子和蛋白，而CSK参与这些因子与蛋白的下游信号转导并且是细胞骨架的重要调控蛋白。本部分实验通过免疫荧光染色观察LPS对新生鼠肺组织肌成纤维细胞迁移和定位的影响及高尔基体极性实验检测LPS对肌成纤维细胞迁移极性的影响。同时测定LPS对第七天新生鼠右肺组织和体外培养的肌成纤维细胞csk蛋白的表达水平及csk的蛋白激酶活性的影响。并进一步用csk抑制剂PP1作用于肌成纤维细胞，通过高尔基体极性实验检验csk活性对其定向迁移的影响；第三部分：选择孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS，待其自然分娩。新生鼠生后6小时内于颈部皮下注射生理剂

6、量的茶碱或等体积生理盐水，每天一次，连续七天。V万方数据上海交通大学医学院硕士学位论文实验分为LPS组，LPS+茶碱（theo）组。取第七天新生鼠左上肺组织做HE染色病理切片并进行形态学分析，各组随机选取4个右肺组织融合，各做一张细胞因子抗体芯片。结果：（1）HE染色结果显示：LPS组较生理盐水（saline）组肺泡数量减少，次级突起数量减少(41±8.5VS75±7.3;13±4.8VS26±5.9,P<0.05)。抗体芯片结果显示，LPS组较生理盐水（saline）组上调的细胞因子中，炎症细胞因子IL-1α，IL-1β，IL

7、-6、IL-12及IL-13明显上调，分别上调了2.6倍、44.5倍、3.6倍、4.4倍、3.6倍；（2）抗体芯片提示LPS组较生理盐水（saline）组的细胞迁移相关因子及蛋白b-FGF，CXCR4及EGFR明显上调，分别上调了7.0倍、13.2倍、8.0倍，而MMP-2，MMP-13，MMP-8分别下调22.4倍,21.3倍,18.9倍。新生鼠肺组织免疫荧光染色结果显示，LPS组较生理盐水（saline）组，肌成纤维细胞主要聚集在初级突起，而迁移至次级突起的数量明显减少。在生后的1、3、7、14天，对照组中分布在次级突起的肌

8、成纤维细胞相对数量迅速增加并逐渐超过定位于初级突起的肌成纤维细胞数，而在LPS组这种趋势相对缓慢。高尔基体极性实验显示，向划痕方向定向迁移细胞数比例LPS组明显少于对照组（0.41±0.03VS0.61±0.03），差异有统计学意义（p<0.05）。LPS上调的