鸡piwi的亚细胞定位及其沉默效率的研究

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1、国家高技术研究发展计划(863计划)项目(No．2011AAl00305)资助SupportedbyNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgram(No．2011AAl00305)国家自然科学基金项目(No．31172199)资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No．31172199)鸡尸fwZ的亚细胞定位及其沉默效率的研究誓究嘉!喜詈蓁副教授l删导师：常国斌副教授YZ4’I了

2、，了q专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009)摘要P咖f基因主要存在于生殖细胞中，在生殖系干细胞的维持和精子发生方面发挥重要作用。其编码的蛋白属于Argonaute基因家族，Argonaute家族因参与RNA干扰而为人们所熟知。迄今为止，国内外学者已在小鼠、果蝇、人、恒河猴、猪、新杆状线虫、鹌鹑等物种中对尸伽f基因进行了一系列的研究，而对鸡P伽f基因的研究甚少。本实验以鸡为模式动物，依据Piwi的eDNA序列，分别构建了pEGFP．C1．Piwi和pcDNA3．1．Piw

3、i两种不同的重组质粒并用脂质体转染NIH．3T3细胞，利用免疫荧光技术定位PIWI蛋白在细胞内的表达情况。同时以鸡原始生殖细胞(PGCs)为实验模型并构建Piwi．shRNAs，采用RNAi技术转染PGCs，运用Real．TuneqPCR技术检测转染24h、48h和72h后PGCs中尸Mf基因、生殖细胞形成和配子发生相关的调控因子(C掰、Dazl)以及调控干细胞多能性及自我更新的转录因子(Nanog、Sox2)的mRNA水平的相对表达量。与此同时，将shRNA质粒用于在活体．鸡胚水平的干扰试验，即采用鸡胚盘

4、下腔注射技术将Piwi．shRNAs注射到44-48h胚龄的鸡胚体内，采集注射5，12，19日龄的鸡胚性腺样品，检测Piwi，及CVH、Dazl、Nanog、Sox2这四种基因的mRNA水平的表达量。为探讨禽类P伽f基因的亚细胞定位及其在生殖干细胞和配子发生中的功能研究提供基础依据。结果表明：1．通过构建两组重组载体的研究发现：利用pEGFP．C1．Piwi载体检测到整个细胞都发光，而使用pcDNA3．1．Piwi载体仅在细胞质中检测到有表达，与在线软件预测结果相一致，与pEGFP．C1．Piwi相比，pc

5、DNA3．1．Piwi载体实验结果更可靠。表明免疫荧光技术更适合PIWI蛋白的定位研究。2．细胞水平上的特异性shRNAs抑制实验结果发现：24h后可检测出明显抑制，48h达到高峰，72h后开始减弱。在3个不同的时间点，空白对照组与阴性对照组相比均无显著性差异(胗O．05)，且3组特异性shRNAs与阴性对照组相比，均具有显著性差异(闷．05)。对于3组特异性shRNAs进行比较发现shRNA．2沉默效率最高，3组特异性shRNAs对鸡尸咖f基因的表达在不同时间均有不同程度的抑制作用，且抑制效果与shRNA

6、序列相对于靶基因的位置和转染时间长短相关。转染48h后的shRNA．2序列靶向抑制Piwi基因表达效率最高。3．鸡胚水平上的特异性shRNAs抑制实验结果发现：在三个时间点，阴性对照组与空白对照组相比，无明显的差异(胗0．05)，3组特异性shRNAs与阴性对照组相比，均具有显著性差异(P<0．05)，在注射后第5天时，尸Mf基因的相对表达量均较低，在第12天时，干涉质粒shRNA．2的P咖f相对表达量最低。三个时间点之间进行比较，出现明显的抑制效果。在第19天时，抑制作用开始减弱。表明不同时间点的3组特异

7、性的shRNAs对鸡PMf表达产生不同程度的抑制作用，且转染时间的长短和shRNA序列相对于靶基因的位置影响尸Mf基因的抑制效果，shRNA．2序列的沉默效率最高，与细胞水平上的实验结果一致。4．Real．TimeqPCR检测PGCs细胞中CVH、Dazl及Nanog、Sox2的相对表达量显示：与阴性对照组相比，抑制尸咖f基因表达后，CVH、Dazl基因表达量上升，两者之间差异显著(尸

8、实验中，与阴性对照组相比，抑制Piwi基因表达后，鸡胚CVH、Dazl4霜7Nanog基因表达量上升，而Sox2基因表达量下降且差异显著(P<0．05)。结果表明，Piwi基因的表达与CVH、Dazl和Nanog存在负相关，与Sox2可能呈现正相关。关键词：Pfwf；鸡；PGCs；shRNA；胚盘下腔注射；Real．TimeqPCRSub·-cellularlocalizationofchickenPiwigen