loc66273变异剪接体2对3t3-l1前脂肪细胞成脂变化和增殖凋亡影响论文

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1、摘要第一部分U．2基因生物信息学分析及细胞定位【目的1初步了解LI．2基因及蛋白的结构、功能和亚细胞定位，研究LI．2基因及蛋白在小鼠各组织分布情况，为后续研究提供基础。I方法l运用生物信息学方法分析LI．2基因及蛋白的结构和功能，在荧光显微镜下观察其亚细胞定位。采用半定量RT．PCR检测小鼠各组织LI．2基因mRNA水平，Western-blot免疫印迹法检测小鼠各组织LI．2蛋白表达水平。CREB荧光素酶反式报告检测系统的高通量筛选技术筛查与CREB相互作用的调控基因。【结果1(1)小鼠LI．

2、2基因位于染色体7E2上，可译框架为789bp，编码122个氨基酸，预测分子量为13．2kDa，等电点为7．77；系统发育分析表明，LI．2基因在多种物种体内高度保守，但与任何已知基因和蛋白质没有明显同源性。保守域分析表明，LI-2中有一个预测的Mth938结构域(氨基酸残基5-120)；(2)LI．2基因在脂肪、骨骼肌、小肠、肺及肾脏组织均有表达，但在脂肪和骨骼肌组织表达较高；LI．2的亚细胞定位提示，GFP．L12融合蛋白在细胞质中弥漫分布，并在核周围有一些高度集中点；(3)CREB荧光素酶报

3、告基因检测系统结果提示过表达LI-2增加了CREB的活性，其活性是空白对照组的2．5倍。【结论ILF2基因在多种物种体内高度保守，提示了它具有重要的功能。LI-2在白色脂肪组织高表达，同时基于定量的CREB荧光素酶反式报告检测系统的高通量功能性筛选平台显示了与CREB转录活性相关的基因中包括LI．2基因。这些信息都提示了LI一2基因可能与成脂分化有关。【关键词]LI-2基因；LI-2蛋白；CREB；生物信息学；亚细胞定位I中图分类号]R34；R543．1+2；R587．2第二部分LI一2在MDI诱

4、导3T3一L1细胞成脂分化过程中的表达变化【目的】研究MDI=联诱导3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中LI一2变化情况。【方法l本部分实验通过油红染色、Western-Bloting印迹、半定量RT—PCR等实验技术观察研究MDI=联诱导3T3．L1前脂肪细胞成脂0、2、4、8天细胞形态、脂滴沉积和LI．2基因mRNA及蛋白水平变化情况。【结果】(1)MDI诱导3T3一L1前脂肪细胞2d后，细胞逐渐变圆变亮，梭形前脂肪细胞逐渐变为椭圆形，胞浆内可见油红0染成亮红色的少量脂滴，诱导分化6d，胞核四

5、周出现较大脂滴；诱导分化后8d，可见9096以上细胞具有成熟脂肪细胞表型。(2)半定量RT-PCR结果显示MDI三联诱导4d后，3T3-L1前脂肪细胞的LI-2mRNA水平显著升高(P

6、发现LI．2基因的mRNA和蛋白水平均较分化早期明显升高，这进一步证实了LI．2与细胞成脂分化相关。【关键词ILI-2基因；LI一2蛋白；成脂分化；3T3．L1前脂肪细胞【中图分类号】R34；R543．1+2；R587．2第三部分过表达LI．2对3T3。L1细胞增殖和分化的影响【目的1在细胞过表达LI．2的情况下，研究LI-2对3T3．LI细胞成脂分化及细胞增殖和凋亡的影响。I方法l(1)月i]pcDNA3．1．L12质粒转染3T3．L1前脂肪细胞，用倒置显微镜分别观察转染质粒pcDNA．3．1．

7、L12，转染peDNA．3．1空白载体以及MDI诱导的未转染任何质粒的三组3T3．L1前脂肪细胞的细胞形态变化，并用油红染色观察细胞脂滴沉积情况；(2)细胞增殖活力检钡IJ(MTI"法)检测上述三组细胞连续培养8天增殖情况：(3)用流式细胞仪检测分析LI．2对细胞凋亡的影响；(4)用流式细胞仪对上述三组细胞进行细胞周期检测；(5)采用实时荧光定量PCR和Westernblot免疫印迹法检测过表达LI．2对3T3．LI细胞成脂分化相关基因的mRNA及蛋白表达水平的影响。l结果](1)过表达LI．2的

8、3T3．L1前脂肪细胞在没有MDI三联诱导下，可见细胞逐渐变圆变亮，梭形成纤维细胞逐渐变为椭圆形，与MDI诱导的3T3．L1前脂肪细胞变化类似，均发生了脂肪分化，仅转染pcDNA．3．1空白载体的3"13．L1前脂肪细胞形态未有明显变化。用油红0细胞染色可见，三组细胞培养8天后，pcDNA．3．1．L12转染3T3．LI前脂肪细胞和MDI诱导的3T3．L1前脂肪细胞在低倍镜和高倍镜下观察均可见大片亮红的脂滴，但pcDNA．3．1空白载体转染的3T3．L1前脂肪细胞培养8天后仅见极少