壳聚糖纳米递药系统的前庭靶向分布及内耳转运机制研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________壳聚糖纳米递药系统的前庭靶向分布及内耳转运机制研究姓名：丁山学号：2111540106院系：药学院学位类型：专业学位专业：药学研究方向：药物研发与转化导师：陈钢论文提交日期：2018年6月21日论文答辩日期：2018年5月26日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年六月广东药科大学硕士研究生学位论文TargetedDistributioninVestibuleandPathwayEntryi

2、ntoInnerEarofChitosanNanoparticulateDrugDeliverySystemCandidate：ShanDingStudentID：2111540106Affiliation：SchoolofpharmacyAcademicDegreeApliedfor：ProfessionaldegreeofpharmacySpeciality：PharmacySupervisor：Pro.GangChenAssistantSupervisor：YangjieLiDayofDefenc

3、e：May2018Degree-Conferring-Institution:GuangdongPharmaceuticalUniversityJune2广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文壳聚糖纳米递药系统的前庭靶向分布及内耳转运机制研究摘要内耳是脊椎动物体内最精细复杂的器官之一，其耳蜗系统负责感知听觉，前庭系统负责调控平衡。内耳疾病是指发生在前庭、耳蜗和听神经等部位的病理变化，其中以失衡和眩晕为主要特征的前庭功能障碍严重影响了患者的正常生活。临床上经鼓室给药由于具有微创、安全

4、及降低全身不良反应等优势常用于治疗内耳疾病，但将药物有效地递送至前庭仍是耳科学专家面临的重大挑战。纳米递药系统的出现为前庭疾病的有效治疗开辟了新方向。圆窗膜是过去公认的物质经鼓室给药进入内耳的主要途径，卵圆窗通常被忽视，但纳米递药系统在前庭膜迷路的分布规律以及如何更有效的到达前庭仍然不清楚。因此，本课题以壳聚糖纳米粒为模型，深入研究该纳米递药系统在前庭器官中的分布规律和进入内耳的转运机制，期望为纳米递药系统在前庭疾病中的应用提供新思路。以壳聚糖分子为载体材料，脂溶性的尼罗红为荧光探针，采用离子交联法制备

5、包载尼罗红的壳聚糖纳米粒，考察其粒径、电荷和形貌，结果显示纳米粒呈形状规整的球形，粒径分布的均一性较好且能以完整的形态从中耳进入内耳外淋巴液。通过激光扫描共聚焦荧光显微镜深入研究了该纳米递药系统鼓室给药后在前庭和耳蜗膜迷路中的细胞分布规律，结果表明壳聚糖纳米粒能够有效的进入前庭系统（椭I广东药科大学硕士研究生学位论文圆囊斑、球囊斑和外半规管壶腹嵴）并被前庭毛细胞、暗细胞等大量摄取，而在耳蜗系统（基底膜和血管纹）几乎没有分布；浓缩10倍的壳聚糖纳米粒同样能够大量聚集在前庭系统，在耳蜗系统仅存在微弱的荧光信

6、号。基于中耳-圆窗膜-耳蜗鼓阶是过去公认的内耳转运途径，但在耳蜗膜迷路中未见纳米粒明显分布，因此我们首先推测壳聚糖纳米粒在前庭和耳蜗膜迷路分布的差异可能与前庭和耳蜗毛细胞对纳米粒摄取的选择性差异有关。为深入研究纳米递药系统在前庭和耳蜗分布规律的机制，以小鼠成纤维细胞L929和源自于耳蜗毛细胞的HEI-OC1为模型考察了该纳米粒在体外细胞中的摄取规律，定性和定量分析结果显示体外细胞能够有效摄取纳米粒且摄取率分别为98.6%和89.1%。为了更好的模拟成年豚鼠内耳器官对纳米粒的摄取，建立了内耳体外器官培养模

7、型，与体内分布结果截然不同的是体外结果显示纳米粒能够显著定位于耳蜗毛细胞的胞浆中。基于壳聚糖纳米粒体内和体外的分布规律以及内耳的解剖结构特点，我们进一步推测壳聚糖纳米粒可能主要以中耳-卵圆窗-前庭途径进入内耳从而靶向分布于前庭器官中。为阐明壳聚糖纳米粒的前庭靶向分布及其内耳转运机制，将壳聚糖纳米粒载入泊洛沙姆407中制成可注射性温敏性凝胶，在体温条件下能够迅速从液态转变成半固态，从而实现分别定点给药至圆窗龛和卵圆窗。通过近红外荧光成像、高效液相色谱分析和激光扫描共聚焦荧光显微镜成像考察纳米粒进入内耳的转

8、运路径，有趣的是，不同于以往大多数研究者所认可的圆窗膜是物质进入内耳的主要途径，实验II广东药科大学硕士研究生学位论文结果均表明壳聚糖纳米粒能够同时通过圆窗和卵圆窗从中耳进入内耳，且经卵圆窗给药能够更有效的到达内耳并分布于前庭器官，说明卵圆窗是壳聚糖纳米粒实现前庭靶向递药的关键途径。为考察壳聚糖纳米粒用于内耳递药的安全性，以L929和HEI-OC1细胞为模型考察了纳米粒的细胞毒性，细胞存活率分别为84.9%~97.1%和92.9%~97.7