文蛤类胡萝卜素代谢相关基因克隆、表达及与壳色变异的相关性分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M150150311上海海洋大学硕士学位论文文蛤类胡萝卜素代谢相关基因克隆、题目：表达及与壳色变异的相关性分析Cloning,ExpressionandShell-color英文题目：VariationAnalysisinCarotenoidGenesoftheHardClam,Meretrixmeretrix专业：渔业研究方向：动物分子育种学姓名：崔宝月指导教师：林志华研究员二零一八年五月二十日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。

2、所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以

3、采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在三年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日I上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注尤仲杰宁波市海洋与水产学会研究员吴雄飞宁波市海洋与渔业研究院研究员李成华宁波大学研究员毛芝娟浙江万里学院教授包永波浙江万里学院研究员浙江万里学院56号答辩地点答辩日期2018.5.24楼208室II上海海洋大学硕士学位论文文蛤类胡萝卜素代谢相关基因克隆、表达及与壳色变异的相关性

4、分析摘要文蛤(Meretrixmeretrix)是我国重要的经济贝类之一，壳表颜色绚丽多彩。已有研究发现，红壳文蛤在生长速度和抗逆方面均显示出优势并且可以遗传给后代，此外红壳文蛤外套膜内比其他壳色文蛤含有更为丰富的类胡萝卜素，并推测类胡萝卜素与红壳色形成密切相关。本研究开展了文蛤“万里红”品种规模化扩繁和大规格苗种培育工作；采用RACE技术首次克隆获得文蛤B类I型清道夫受体(Mm-SRBI)和β－胡萝卜素－15，15'－加氧酶(Mm-BCMO1)基因的基因组序列全长，荧光定量PCR方法分析了两个基因表达特征，并用生物学分析软

5、件对它们结构和功能进行预测；同时采用直接测序法对Mm-BCMO1外显子以及启动子区域进行SNP位点筛查及壳色相关性分析；依据Mm-BCMO1基因序列设计酶切引物进行原核表达合成抗体进行免疫组化。本研究旨在为文蛤壳色形成提供理论基础。主要研究结果如下：1.以文蛤“万里红”品种G5代群体为亲本，开展了规模化扩繁和大规格苗种培育。100kg“万里红”亲贝，扩繁出苗种文蛤约1.5亿粒，随机选取1龄文蛤5000粒发现均为红色壳。即经过5代选育遗传率为100%。红白壳类胡萝卜素含量测定发现在外套膜和内脏团中类胡萝卜素的含量极显著高于白壳

6、（P<0.01）。2.克隆得到Mm-SRBI基因的cDNA全长1676bp，开放阅读框1515bp，编码504个氨基酸，结构域预测发现有一个CD36结构域；氨基酸序列比对发现，与华贵栉孔扇贝的同源性最高(55%)，与其他物种的相似性在34%—40%，表明该基因变异较大；在Mm-SRBI基因中扩增出12个内含子，均存在于开放阅读框中，且都遵循GT-AG原则；荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明，Mm-SRBI在闭壳肌、外套膜、斧足、鳃、内脏团和水管6个组织均有表达，其中在外套膜中表达量显著高于其他组织（P<0.01），这可

7、能与外套膜中类胡萝卜素含量较高有关；不同壳色群体外套膜中基因表达分析表明，Mm-SRBI在黑斑和红壳文蛤中的表达量显著高于白壳文蛤(P<0.05)；克隆得到Mm-SRBI基因的近端启动子序列为2665bp，其中包括5'端UTR区50bp，软件预测含有6个转录起始位点和多个转录因子结合位点。3.克隆得到文蛤BCMO1（Mm-BCMO1）基因序列总长度8582bp，包括9个III上海海洋大学硕士学位论文内含子和10外显子。内含子长度不同，3号内含子最短为333bp，7号内含子最长为1633bp，其余内含子在363—1323bp之

8、间。荧光定量结果表明，Mm-BCMO1基因在白壳和红壳的6个组织均有表达，而在内脏团和外套膜的表达量极显著高于其他组织（P<0.01）；该基因不同发育时期均有表达，在壳顶幼虫、眼点幼虫以及稚贝极显著高于其他时期（P<0.01）。克隆得到该基因的近端启动子序列为2479bp，其中包括5'端U