子痫前期患者脱落滋养细胞激活血管内皮细胞的分子机制研究

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万方数据复旦大学硕士学位论文指导小组成员名单陈奇教授ProfessorChamleyLarry2 万方数据复旦大学硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3第一章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61子痫前期的发病机制学说⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．1胎盘形成不良⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2免疫适应不良和系统性炎症反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71_3血管内皮细胞功能障碍⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．4其他危险因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．脱落滋养细胞在子痫前期发病机制中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．1、正常妊娠中滋养细胞的脱落⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2、子痫前期患者滋养细胞的脱落⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯103．本课题研究目标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11第二章正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第一部分：子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节通过IL-113相关途径活化血管内皮细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．153结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．214讨{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30第二部分：脱落滋养细胞微颗粒在子痫前期发病机制中的作用：激活血管内皮细胞。331．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332。方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．344．讨{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39个人简历、研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46致j谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．47l宗j2盎⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯z18论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．573 万方数据复旦大学硕士学位论文中文摘要子痫前期是妊娠期特有疾病，临床表现为高血压、蛋白尿等，病理生理基础是全身广泛的血管内皮细胞损伤。子痫前期的发病机制尚不十分明确，但是胎盘在子痫前期发病中发挥重要作用得到了广泛的认可。正常妊娠过程中，脱落滋养细胞以“凋亡”形式为主，研究提示子痫前期患者脱落滋养细胞转变为坏死样性质，异常的脱落滋养细胞进一步引起血管内皮细胞功能障碍，是导致子痫前期发生和发展的一个重要因素。目前，尚无研究报道子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞能否激活血管内皮细胞。本课题研究子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节(TD)是否能激活血管内皮细胞及其可能的机制；子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞微颗粒(STBM)的生物学性质是否改变，血管内皮细胞对滋养细胞微颗粒的吞噬和清除过程，及继发的血管内皮细胞功能障碍和分子机制。为子痫前期血管内皮细胞激活的病理机制和临床治疗提供实验依据。第一部分：子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节通过IL-11t相关途径。活化血管内皮细胞目的：研究子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节是否能活化血管内皮细胞及可能的分子机制。方法：用脱落滋养细胞体外收集模型模拟滋养细胞的脱落过程，收集子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞节，经子痫前期患者血清或相同孕周、正常妊娠对照组血清处理早孕期绒毛组织来源的滋养细胞节。将上述滋养细胞节用于处理血管内皮细胞，通过血管内皮细胞表面ICAM．1的表达和单核细胞粘附实验检测血管内皮细胞的活化状态。为了进一步研究滋养细胞节活化血管内皮细胞的机制，上述滋养细胞结中炎症细胞因子IL．1D及其上游分子pro．caspase．1、activecaspase．1的表达。为了证实IL．113在活化血管内皮细胞中的作用，重组人IL．113用于处理血管内皮细胞，诱发血管内皮细胞的激活。结果：子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞节和经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节可以激活血管内皮细胞，表现为血管内皮细胞表面ICAM．1的表达升高和单核细胞粘附增加，上述滋养细胞节中IL．1B及其上游分子pro．caspase．1、activecaspase．1表达均增加，重组人几．113可激活血管内皮细胞，证实了血管内皮细胞的激活与IL．1D通路活化相关。结论：子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节和经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节可以通过IL．1D相关途径活化血管内皮细胞。第二部分：血管内皮细胞吞噬和清除滋养细胞微颗粒并继发活化1 万方数据复旦大学硕士学位论文目的：研究子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞微颗粒(STBM)被血管内皮细胞吞噬及清除过程，及其继发的血管内皮细胞活化作用和分子机制。方法：用脱落滋养细胞体外收集模型模拟滋养细胞的脱落过程，收集经子痫前期患者血清或相同孕周、正常妊娠对照组血清处理早孕期绒毛组织来源的脱落滋养细胞微颗粒(STBM)。为了研究滋养细胞微颗粒(S113M)被血管内皮细胞吞噬和清除的机制，在加入或不加吞噬抑制剂的条件下，荧光标记的单层血管内皮细胞与滋养细胞微颗粒(STBM)相互作用不同的时间段，并洗去未被吞噬的滋养细胞微颗粒(STBM)，用激光共聚焦显微镜成像分析吞噬和清除过程。将上述不同来源的滋养细胞微颗粒(STBM)用于处理血管内皮细胞，通过血管内皮细胞表面ICAM．1的表达检测血管内皮细胞的活化状态，并检测条件培养液中IL．1B水平。结果：血管内皮细胞以时间依赖方式吞噬和清除滋养细胞微颗粒(STBM)，并且可以激活血管内皮细胞，表现为血管内皮细胞表面ICAM．1的表达升高，同时条件培养液中IL．113分泌增加。结论：血管内皮细胞以时间依赖方式吞噬和清除滋养细胞微颗粒(STBM)，经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒(STBM)可以激活血管内皮细胞。综上所述，子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节可以通过IL．1p相关途径活化血管内皮细胞。血管内皮细胞以时间依赖方式吞噬和清除滋养细胞微颗粒(STBM)，血管内皮细胞在吞噬经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒(STBM)后发生活化。这些研究结果提示子痫前期患者脱落滋养细胞可被血管内皮细胞吞噬，是导致血管内皮细胞激活的胎盘因素之一，为子痫前期的临床治疗靶点提供了实验依据。关键词：子痫前期，滋养细胞节，滋养细胞微颗粒，血管内皮细胞激活，分子机制中图分类号：R71 万方数据复旦大学硕士学位论文AbstractPreeclampsiaisapregnancy-specificdisorderwhichcharacterizedbyhypertension，proteinuriaandwidespreadmaternalendothelialdysfunction．Thepathogenesisofpreeclampsiaisunclear,butitiswellacceptedthatthepresenceofplacentaisresponsibleforthedevelopmentofpreeclampsia．Itissuggestedthattrophoblasticdebrisshedfromplacentachangingfrombeingapoptosis．1iketobeingmorenecroticcontributestothepathogenesisofpreeclampsia．ButwhethertrophoblasticdebrisproducedbypreeclampticplacentaeactivatestheendotheliumremainsunansweredInthisstudy,weinvestigatedwhethertrophoblasticdebrisfrompreeclampticplacentaeactivatedendothelialcellsandthepossiblemechanism，andwhethersyncytiotrophlastmicroparticlesfromplacentaecanbephagocytosedandabsorbentbyendothelialcellsandsubsequentlymodifyingtheresponseofendothelialcellstoSTBM，SOastosupplyexperimentalevidenceforthepathophysiologyofendothelialcellactivationandtargetofclinicaltreatmentofpreeclampsia．1·TrophoblasticdebrisextrudedfrompreeclamptieplacentaeactivatesendothelialcellsinanIL-lpassociatedpathwayObjectiVes：InvestigatedwhethertrophoblasticdebrisfrompreeclampticplacentaeactivatedendothelialcellsandtheroleoflL．1Bintheactivationofendothelialcells．Method：Trophoblasticdebrisfrompreeclampticornormotensiveplacentaewereexposedtoendothelialcells．Furthermore，trophoblasticdebrisfromnormalfirsttrimesterplacentalexplantsthatwereculturedindividuallywithpreeclampticornormotensiveseraWaSalsoexposedtoendothelialcells．Endothelialeel]activationwasquantifiedbycellsurfaceICAM．1andU937adhesiontoendothelialcells．ThelevelsofIL一1D，pro-caspase一1andactivecaspase．1inthetrophoblasticdebrisweremeasured．ToconfirmtheroleofIL-113oninducingendothelialcellactivation，endothelialcellsweretreatedwithhumanrecombinantIL．1Dfor24hours．Results：Comparedtocontrols，thelevelsofICAM．1andU937adhesiontoendothelialcellsweresignificantlyincreasedfollowingexposureoftheendothelialcellstotrophoblasticdebrisfrompreeclampticplacentaeorplacentaetreatedwithpreeclampticsera．ThelevelsIL-113，pro-caspase-1andactivecaspase．1weresignificantlyincreasedinbothtrophoblasticdebrisfrompreeclampticplacentaeandplacentaetreatedwithpreeclampticsera．Conclusion：Theseresultssuggesttrophoblasticdebrisproducedinpreeclamptic穹 万方数据复旦大学硕士学位论文pregnanc,iesorinplacentaetreatedwithpreeclampticseraactivatedendothelialcells．TrophoblasticdebriscontainingIL-113maybeonemechanismtoinduceendotheliumactivationinpreeclampsia．2．TheroleofsyncytiotrophoblastiemicroparticlesonendothelialactivationObjectives：InvestigatewhethersyncytiotrophlastmicroparticlesfromplacentaecanbephagocytoseandabsorbentbyendothelialcellsandsubsequentlymodifyingtheresponseofendothelialcellstoSTBM。Method：TodetecttheabilityofphagocytosisandclearanceofSTBM，STBMwereincubate．dwiththeconfluentmonolayersofendothelialcellsfor24hours，thecellswerethenexaminedbyconfocalmicroscopyusingaLeicamodelTCSSP2confocalmicroscope．Normalfirsttrimesterplacentalexplantswereculturedindividuallywithpreeclampticornormotensivesera．thenS113Mwerecollectedandexposedtoendothelialcells．EndothelialcellactivationWaSquantifiedbyceilsurfaceICAM-1．ThelevelsofIL-lpinconditionedmediumfromendothelialcellsculturedwithSTBMwerealsoquantifiedbyELISA．Results：EndothelialcellsphagocytoseSTBMandthephagocytosisofSTBMWaSsignificantlyinhibitedbycytochalsinD，aninhibitorofphagocytosis。PhagocytosisofSTBMwasincreasedinatimedependentmannerEndothelialcellbecameactivatedbythephagocytosisofSTBMfromplacentalexplantsthatWaStreatedwithpreeclampticsera，withincreasedexpressionofICAM-landreleaSingofIL-1pinconditionedmedium．Conclusion：Endothelialcellsphagocytosetrophoblastmicroparticlesfromplacentalexplants，andmicroparticlesfromplacentalexplantstreatedwithpreeclampticbutnotnormotensiveseraactivatedthephagocytosingendothelialcellsasindicatedbyincreasedICAM-1andIL．1bexpression．．Inconclusion，trophoblasticdebrisextrudedfrompreeclampticplacentaactivatesendothelialcellsinanIL-1Dassociatedpathway,STBMcanbephagocytosedandabsorbentbyendothelialcellsinatimedependentmannerandSTBMfromplacentalexplantstreatedwithpreeclampticbutnotnormotensiveserainduceendothelialcellsactivation．Theseresultsindicatetrophoblasticdebrisisaplacentalfactorwhichinduceendothelialcelldysfunction，andmaybeusedasatherapeutictargetforpreeclampsia．4 万方数据复旦大学硕士学位论文Keywords：Preeclampsia；TrophoblasticdebristSyncytiotrophlastmicroparticles；Endothelialceilsactivation；Mechanism5 万方数据复旦大学硕士学位论文第一章前言子痫前期是妊娠期特有疾病，发病率约为2-8％，临床特征为：怀孕前血压正常的孕妇在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿等。轻度子痫前期的症状一般不明显，重度子痫前期的孕妇可出现头疼、上腹部或肝区疼痛、视觉模糊等症状。子痫前期是涉及多器官的疾病，其严重并发症包括：子痫、中风、肾功能衰竭、肺水肿、I-IELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板升高)、DIC(弥散性血管内凝血)等。子痫前期是引起母胎发病率和死亡率的主要原因，在世界范围内，每年导致约50000孕、产妇死亡，在中低收入国家，10-15％的孕产妇死亡与子痫前期、子痫直接相关：子痫前期导致多达12％的小于胎龄儿出生，其中1／5发生于早产，同时围产儿死亡率增加，在发展中国家，约1／4的死产或新生儿死亡与子痫前期、子痫相关⋯。临床研究发现，曾患子痫前期的妇女发生心脏病、脑血管疾病、外周血管疾病、肾脏病变如局灶性。肾小球硬化、微量白蛋白尿等的风险明显增加心1，出生于患子痫前期孕妇的胎儿，其远期发生糖尿病、心血管疾病、高血压病等的风险也明显增加聆1。目前尚无有效的治疗子痫前期的方法，主要是为了减少其并发症，硫酸镁被普遍应用于控制和预防子痫的发生，重度子痫前期患者应用降压药物控制血压，能使病情完全缓解的方法是胎儿、胎盘的娩出。胎盘的娩出发挥更重要的作用，曾有病例报道，单纯胎儿娩出而胎盘未娩出，不能使母体的症状缓解H1，提示胎盘在子痫前期发病机制中的重要作用。因此，子痫前期的治疗目标是：在保证母胎安全的前提下，尽可能延长孕周，使胎儿成熟哺，。1子痫前期的发病机制学说子痫前期的发病机制至今尚未完全阐明，多种因素参与了子痫前期的发病过程。母体因素、遗传因素、免疫适应不良、胎盘形成不良、血管内皮细胞损伤等相互作用促成了子痫前期的发生、发展。1．1胎盘形成不良正常妊娠是一个高度协调的过程，滋养细胞是受精卵从桑葚胚期到囊胚期首先分化出的细胞系，囊胚植入子宫内膜后，滋养细胞分化为两种基本的亚型一一外层的合体滋养细胞和内层的细胞滋养细胞，合体滋养细胞与母体组织直接接触，成为母胎界面的结构和功能屏障，细胞滋养细胞发挥类似干细胞的功能，其快速分裂、融合形成合体滋养细胞，从而使胎盘不断生长扩大。绒毛外滋养细胞逆行浸润并逐渐取代子宫螺旋小动脉内皮细胞和血管平滑肌细胞的过程称为“血管重铸”，细胞滋养细胞转换为“内皮细胞表型”，并表达粘附分子，此过程持续至中 万方数据复旦大学硕士学位论文孕中期，深度达子宫肌层内l／3，使子宫螺旋动脉从高阻力、低容量的血管转变成低阻力、高容量的血管，不受母体血管舒缩神经的控制，为胎儿提供发育所需的、持续增加的氧气和营养供应【6喝J。但是在子痫前期患者，滋养细胞浸润子宫蜕膜和肌层螺旋小动脉的程度和深度不足，表现为浸润蜕膜和肌层的深度表浅，且小螺旋动脉有平滑肌细胞的残留19。11|，螺旋动脉血管重铸异常导致低容量、高阻力的胎盘血管形成，不能为胎盘、胎儿提供足够、平稳的血液供应，进而发生胎盘缺血、缺氧。胎盘的缺血缺氧可促使胎盘发生氧化应激损伤，释放细胞因子、抗血管生成因子、异常滋养细胞碎片等，这些异常因子进一步导致母体过度的炎症反应、血管内皮细胞系统损伤，出现子痫前期的临床症状。然而，子宫螺旋动脉重铸不良也发生在单纯的FGR(胎儿生长受限)患者的胎盘Il21，提示了其他因素也参与了子痫前期的发病过程。1．2免疫适应不良和系统性炎症反应由于胎儿有一半的基因来自父亲，所以，对于母体的免疫系统而言，胎盘和胚胎是一个“半同种异基因移植物”。然而，母体的免疫系统，可暂时识别胎盘为“自身成分”，且在正常妊娠中不引起免疫排斥反应【13I。主要是由于滋养细胞不表达主要组织相容性复合物I(HLA．A和HLA．B)类和II类分子(分别介导急性和慢性排斥)，使胎盘得以逃避母体的免疫监视系统，滋养细胞表达HLA．G，HLA．C，HLA．E，通过与细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞表面抑制性受体相互作用避免母体的免疫攻击114I。HLA．G可与细胞毒性T细胞矛r1NK细胞表面的受体相互作用，抑制T细胞和NK细胞的溶解细胞功能，从而使滋养细胞可与母体的免疫细胞共存【15|。在正常妊娠中，母胎界面T细胞表型从Thl型优势转变为Th2型优势，而子痫前期患者母胎界面未发生T细胞表型的转变，表型为Thl型细胞因子(包括IL．1、IL．2、IFN．1，等)占优势，Th2型细胞因子(IL．10、IL．5等)处于低表达水平11刚。IL．10可以通过激活母体界面滋养细胞和单核细胞表面HLA．G的表达，使胎儿不受母体的免疫排斥【17J。子痫前期患者，胎盘缺血缺氧释放炎症细胞因子、抗血管生成因子、损伤相关的模式分子(damage．associatedmolecularpattern，DAMP)等可激活单核细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞等，使机体持续处于炎症反应状态，炎症因子可进一步激活机体适应性免疫反应，T细胞亚型改变包括Thl型T细胞占优势、Treg细胞活性下降、n17淋巴细胞增多、Tre∥Thl7LL值下降【181。子痫前期患者胎盘中的CDl9+CD5+B细胞可产生血管紧张素II1型受体自身抗体(angiotensionIItypeIrecepto卜agonisticautoantibody,ATl一AA)，70．85％的子痫前期患者有ATl．AA的IgG亚基的表达，与高血压、蛋白尿、sFlt-1(solublefms．1iketyrosinekinase．1)的表达相关，并且可能与子痫前 万方数据复旦大学硕士学位论文期的严重程度有关[19]。1．3血管内皮细胞功能障碍血管内皮细胞有很多重要的功能：通过释放血管收缩因子和血管舒张因子调节血管腔的大小，通过不同的可溶性因子发挥抗凝作用、抗血小板聚集功能、溶解纤维蛋白作用等。子痫前期患者，循环中血管内皮损伤的生物标志分子水平发生了改变【20|。血管内皮细胞损伤，微血管痉挛，是子痫前期的母体临床表现的病理基础，血管内皮细胞激活发生于子痫前期临床症状出现前数周12¨。子痫前期发病早期阶段，子宫螺旋动脉重铸不良导致胎盘缺血缺氧，缺血缺氧的胎盘进一步释放一系列有害因子，包括sFlt．1、ATl．AA、肿瘤坏死因子、IL．6等引起母体血管内皮细胞的广泛激活【221。表现为内皮素(endothelin)、活性氧物质等生成增加；血管内皮细胞对血管紧张素II的敏感性增加；血管舒张因子如NO(nitricoxide)、前列环素(prostacyclin)生成下降，以上因素综合作用导致广泛的血管内皮细胞功能激活、外周血管阻力升高【20，231。肝脏血管内皮细胞损伤可出现上腹部疼痛、恶心、肝酶升高，严重者可导致诱发HELLP(hemolysis，elevatedliverenzymes，lowplatelets)综合征；大脑血管内皮细胞损伤诱发神经紊乱，甚至子痫发生；。肾脏血管内皮细胞损伤，导致。肾小球血流灌注减少、蛋白尿：血管内皮细胞损伤促使微血管溶血性贫血发生，血管通透性增加导致血容量下降、低蛋白血症导致肺部或下肢水肿等123|。1．4其他危险因素、。流行病学研究发现子痫前期具有家族多发性，父系和母系子痫前期病史均与子痫前期的发病易感性有关【241。前次患子瘸前期的妇女，再次发生子痫前期的危险性±曾}J116倍，抗磷脂抗体综合症的妇女发生子痫前期的危险性增加9倍【25|。多胎妊娠也是子痫前期的危险因素之一，如三胎妊娠的患子痫前期的危险性高于双胎妊娠，提示胎盘体积增大在子痫前期的发病中发挥作用。其他增加子痫前期发病的高危因素包括：初产妇，更换性伴侣，妊娠间隔时间长，父源性抗原精液暴露有限，血管和纤维结缔组织疾病如系统性红斑狼疮。尤其是心血管疾病的共同高危因素也增加子痫前期的患病风险，如高龄，胰岛素抵抗，肥胖，系统性炎症反应，糖尿病，肾脏疾病等【25]。 万方数据复旦大学硕士学位论文2．脱落滋养细胞在子痫前期发病机制中的作用2．1、正常妊娠中滋养细胞的脱落1893年，德国科学家Schmorl首次在死于子痫的孕妇肺血管中发现了多核的脱落滋养细胞，并提出滋养细胞脱落和子痫前期发病机制有关。随后研究发现，在正常妊娠中，从孕6周起，胎盘母体面合体滋养细胞形成膜包裹的多核结构一一滋养细胞节(trophoblasticdebris，TD)，从胎盘母体面脱落随子宫静脉进入母体血液循环，随血流汇聚并被阻挡于肺血管床，很少进入外周血液循环。从早孕晚期，有大量体积较小的脱落滋养细胞微颗粒(syncytiotrophoblastmicroparticlesSTBM)经肺循环进入母体外周外周血液循环中，且在子痫前期患者，滋养细胞微颗粒的数量明显增加【26I。一些研究者发现在融合前的细胞滋养细胞中发现caspase8的活化，推测细胞滋养细胞融合为合体滋养细胞的同时启动了凋亡机制口7|。脱落滋养细胞在大小和核物质方面有很大的变异，较大的可达100um长，直径60．200um，通常有20．50个核仁，但也可少至2．3个核【28】；单核细胞滋养细胞、滋养细胞微颗粒(STBM，≥1OOnm)，滋养细胞纳米粒子或外泌体(trophoblastnanoparticlesorexosomes，≤1OOnm)也可从胎盘脱落并进入母体外周血液循环口引。Attwood币1]Park经过尸体解剖发现：产后3天内死亡的产妇，肺部脱落滋养细胞节的数量最多，产后15天死亡的产妇肺部解剖未发现脱落滋养细胞，推测被驱逐至肺部的脱落滋养细胞节寿命大概有3．14天【30】。被阻挡于肺部的脱落滋养细胞节并没有引起肺毛细血管床的阻塞，说明母体肺部和循环中存在一种能清除滋养细胞碎片的机制，且外周静脉中脱落滋养细胞的数量远远低于子宫静脉【311，所以脱落滋养细胞节可能主要在肺部被清除。由于肺部的巨噬细胞主要存在于肺泡，而不是肺血管中，脱落滋养细胞碎片在肺部的清除机制尚不明确，体外试验中证明了血管内皮细胞可吞噬脱落滋养细胞【321。A吒—“‘t、?^．r。4一一一弘，‘一。Itil：滋养细胞脱鞴：过程【33】：(A)早孕期胎盘体外培养组织，可见滋养细胞核聚集 万方数据复旦大学硕士学位论文形成滋养细胞结(syncytialnuclearaggregates／syncytialkontsTD)，TD从滋养细胞表面被挤出，并脱落至绒毛间隙(箭头所示)。(B)早孕期胎盘组织培养收集的一个滋养细胞结，表明TD是体积较大的多核细胞聚集体．在培养胎盘组织的过程中，用绿色荧光染料孵育标记脱落滋养细胞胞浆，细胞核用DAPI染色。当外周血来源的巨噬细胞(peripheralbloodderivedmacrophages，PBMC)吞噬脱落滋养细胞节后，细胞表面MHC．II类分子、单核细胞趋化因子(monocytechemoattractantprotein．1，MCP．1)、共刺激分子、细胞间粘附分子(inter．cellularadhesionmolecule．1，ICAM．1)表达下调，具有免疫抑制功能的吲哚胺2．3双加氧酶(indoleamine2，3．dioxygenase，IDO)表达上调，诱导抗炎症因子IL．10，ILlRa等表达上升，促炎症因子IL．1D，ILl2，IL．8等表达下调，说明PBMC吞噬正常脱落滋养细胞后可诱导母体免疫耐受、避免炎症反应【34|。NTD可刺激单核细胞HLA-DR／DP表达增加，增强单核细胞的抗原提呈活性，可能导致适应性免疫反应的激活p引。正常妊娠中，母体外周血液循环中的滋养细胞微颗粒(STBM)可与单核细胞和B细胞结合，诱导单核细胞和B细胞吞噬滋养细胞微颗粒(STBM)并释放多种细胞因子(TNFa、MIP．10L、IL．10【、IL．1D、IL．6、IL．8等)，I型免疫(细胞免疫和移植物排斥反应)相关的细胞因子IP．1O表达下调135J，因此，在正常妊娠中，滋养细胞微颗粒(STBM)可能有助于母体免疫状态向II型(体液免疫相关)倾斜。2．2、子痫前期患者滋养细胞的脱落子痫前期患者，脱落的滋养细胞数量明显增加，并被认为是以坏死的形式脱落。坏死的脱落滋养细胞(necrotictrophoblastdebris，NTD)已经被认为是胎盘释放的有害因子之一，在子痫前期发病机制中起重要作用【361。早孕期大鼠血液循环中注入NTD，可诱发晚孕期鼠血压高于正常对照组，进一步证明了NTD在子痫前期发病中的作用【371。体外实验也证实，肺血管内皮细胞吞噬凋亡形式的脱落滋养细胞后，血管内皮细胞不发生功能障碍，并且可以保护血管内皮细胞不受因坏死的脱落滋养细胞或炎性因子IL一6或内皮细胞激活因子LPS、PMA等的刺激而发生功能异常。这种效应依赖于血管内皮细胞吞噬凋亡的脱落滋养细胞节，但是这种保护效应是短暂的，推测在正常妊娠过程中，体内脱落的凋亡滋养细胞不断从胎盘脱落进入母体血液循环中，在保护血管内皮细胞功能中发挥重要作用【3引。但是子痫前期患者胎盘表面滋养细胞倾向于以非凋亡或坏死的形式脱落。血管内皮细胞吞噬坏死形式死亡的脱落滋养细胞后，内皮细胞间粘附分子表达上升，单核细胞粘附增加，同时血管内皮细胞释放IL．6、TGF]BI等促炎症因子，这些炎症因子可进一步引起未直接吞噬坏死脱落滋养细胞远处的血管内皮细胞发生活化、抑制血管内皮细胞的增殖。同时也诱发胎盘组织产生更多坏死的脱落滋 万方数据复旦大学硕士学位论文养细胞，形成一个正反馈机制(32，39]。子痫前期患者的脱落滋养细胞中sFlt一1水平升高，并且携带有代谢活性的sFlt．1mRNA，推测子痫前期患者血清中sFIt-1水平升高与脱落滋养细胞进入母体循环后可能发挥转录、翻译功能、新合成sFlt．1蛋白有关【401，后者可进一步影响血管内皮细胞的屏障功能。与正常妊娠相比，早发型子痫前期患者外周血滋养细胞微颗粒(STBM)水平明显升高，然而，在胎儿宫内生长受限患者的外周静脉血中滋养细胞微颗粒(STBM)水平与相同孕周、正常对照组无明显差异，提示子痫前期孕妇的系统性炎症反应和心血管系统症状与循环中升高的STBM水平有关Hl|。STBM的生物学性质改变，也是导致失控的炎症反应的重要因素，在缺氧条件下收集的STBM可诱发单核细胞分泌1L．6511TNFot的量明显升高【4引，并且来自子痫前期患者胎盘的STBM可激活单核细胞，IL．1B、IL．6、MIP．10t、TNFⅨ等炎症因子分泌明显增加，而正常足月胎盘和早孕胎盘来源的STBM则可以抑制单核细胞对炎症刺激的反应程度143]。子痫前期患者STBM携带一些危险因子导致靶细胞的损伤：组织因子表达高于正常孕妇可激活凝血系统导致炎症状态【4钔，抗血管生成分子sFlt．1和endoglin可激活血管内皮细胞一5|。血管内皮细胞被STBM激活后释放的可溶性因子可进一步激活淋巴细胞[46]。3．本课题研究目标本课题组前期体外研究发现，经过抗磷脂抗体、IL．6，TGFl5．1或TNFll处理的绒毛组织，脱落滋养细胞的数量增加，TD中caspase3&7活性下降，倾向于以坏死形式脱落，并可诱发血管内皮细胞的活化【47，4引。目前，尚无研究证明子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞节可激活血管内皮细胞，因此本课题，通过体外实验研究子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞节是否能激活血管内皮细胞，并研究诱发血管内皮细胞损伤的可能的分子机制。用子痫前期患者血清处理早孕期绒毛来模拟子痫前期患者体内环境中滋养细胞节的脱落，进一步验证子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞节激活内皮细胞的能力和分子机制。从早孕晚期，在外周血液循环中即出现大量滋养细胞微颗粒，可与单核细胞和B细胞结合，诱导单核细胞和B细胞吞噬滋养细胞微颗粒，并释放多种细胞因子lj”。子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞微颗粒携带的危险因子可激活免疫细胞释放炎症因子，正常足月胎盘和早孕胎盘来源的STBM则可以抑制单核细胞对炎症刺激的反应程度【4引。滋养细胞微颗粒大量存在于母体血液循环中，可能是连接胎盘损伤和母体血管内皮功能障碍的一个重要因素，目前尚无研究报道，血管内皮细胞是否能吞噬滋养细胞微颗粒。本课题研究子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞微颗粒(STBM)能否被血管内皮细胞吞噬和清除，是否继发血管内皮细胞功能的激活和炎症因子的释放。 万方数据复旦大学硕士学位论文第二章正文第一部分：子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节通过IL-113相关途径活化血管内皮细胞1．材料1．1细胞株人微血管内皮细胞HMEC-1购买于美国国家传染性疾病中心。1．2主要试剂试剂名称生产厂家MCDBI31培养液Invitrogen公司DMEM／F12培养液Invitrogen公司细胞示踪剂CMTPX(Red)Invitrogen公司CD45+白细胞抗体磁珠Invi仃ogen公司胎牛血清FBSInvitrogen公司ICAM．1，CD54单克隆抗体SerotecorPeprotech重组人IL．1DSerotecorPeprotechIL．1DELISA试剂盒BD兔抗caspase．1单克隆抗体R&D鼠抗pro．caspase．1单克隆抗体R&D0．25％胰蛋白酶．EDTAGibcoHoechestInvitrogen公司荧光染料Invitrogen公司BCA蛋白浓度定量试剂盒ThermoScientific蛋白酶抑制剂ThermoScientific预染蛋白MarkerThermoScientific兔抗鼠二抗R&D辣根过氧化物酶标记的二抗R&DECL发光液ThermoScientific1．3主要仪器’V～resternblot实验配套设备(美国BIO．RAD公司)、恒温水箱、电子天平、台式高速离心机、．80℃超低温冰箱、细胞培养箱、微量移液器、匀浆器、凝胶图像分析系统、ImageQuantLSA3000扫膜仪、相差显微镜(Nikon公司)、冰冻切片机(Leica，德国)、SP2激光共聚焦显微镜(Leica，德国)、酶标仪 万方数据复旦大学硕士学位论文计算机系统等。1．4实验溶液配置(1)1卡PBS缓冲液(PH7．2．7．4)NaCl89KCIO．29Na2HP041．549KH2P040．29ddH201L(2)10木PBS缓冲液(PH7．2—7．4)NaCI809KCI29Na2HP0415．49KH2P0429ddH201L(3)O．05％PBST缓冲液(PH7。2．7．4)1木PBSlLtween一200．5ml(4)RIPA裂解液(10m1)在冰上配置100mMTris／Nacl5mllO％NP．401ml10％sodiumdeoxycholatelml1％SDSlml5水蛋白酶抑制剂19509lPMSF509l(5)封闭液脱脂奶粉5．0gPBST100mL(6)SDS电泳凝胶分离胶dH204．0ml1．5MTris·HclPH8．82．5ul30％丙烯酰胺3．3ml10％SDS0．1ml10％AP0．1mlTEMED】5ul3．3 万方数据复旦大学硕士学位论文(7)SDS电泳凝胶浓缩胶dH204．0ml1．5MTris·HclPH8．80．75ul30％丙烯酰胺1．0mllO％SDS60ul10％AP60ulTEMED20ul(8)电泳缓冲液Glycine14．49Tris3．0279SDS1gMQH201L(9)转膜缓冲液体Glycine14．49Tris3．0279MQH20900ml甲醛100ml(10)膜染色液考马斯亮兰0．29甲醇80ml乙酸2mlddH20118ml(11)膜脱色液醋酸45ml甲醛45mlMQH2010ml(1乃上样缓冲液(5X，5m1)1MTris-H．CI(PH6．811．25ml甘油’2．5mlS,DS0．59溴酚蓝25mgddH205ml500u1分装后，室温保存，使用前将13．巯基乙醇加入到每小份中，加入B．巯基乙醇后的上样缓冲液，可以在室温下保存1个月左右。14 万方数据复旦大学硕士学位论文1．5耗材细胞培养瓶、6孔细胞培养板、12孔细胞培养板、96孔细胞培养板、离心管、筛网状容器、直径10cm细胞培养皿、一次性镊子、手术刀、手套(ComingCostal公司)、lOml移液管、25mi移液管(Eppendorf公司)、Eppendorf管、移液器吸头、15ml离心管(Axygen公司)、NC膜(PALLLifeScience公司)1．6组织及血液标本本研究经新西兰奥克兰当地健康及残疾伦理委员会审查通过。实验中所用的人体组织或血样本均取得患者的书面知情同意。早孕绒毛组织、子痫前期患者胎盘、正常妊娠足月胎盘、子痫前期患者血清及相同孕周、正常孕妇血清。子痫前期患者入选标准(TheAmericanCollegeofObstetriciansandGynecologists2002，ACOG)：妊娠20周后出现BP≥140／90mmHg，蛋白尿定量：尿蛋白≥300m∥24h或随机蛋白尿(+)。重度子痫前期：收缩压≥160mmHg，或舒张压≥110mmHg。排除标准：慢性高血压合并妊娠：妊娠前或妊娠20周前检查发现高血压，但妊娠期无明显加重；慢性高血压病并发子痫前期：高血压妇女于孕20周以前无蛋白尿，若孕20周后出现尿蛋白≥300m∥24h，或妊娠前或妊娠20周前突然出现蛋白尿增加，血压进一步升高或血小板进一步减少(<100冰109／L)：慢性肾炎合并妊娠等。正常对照组：正常妊娠血清与子痫前期组患者孕周相匹配，由于部分子痫前期患者发生早产，正常妊娠胎盘未取得与子痫前期患者孕周相匹配的胎盘组织。无妊娠合并症及其他慢性疾病、无子痫前期病史。早孕期绒毛组织取自2012年7月至2012年12月，在奥克兰大学附属医院妇产科，孕8．12周自愿行人工流产术终止妊娠的正常妇女。人工流产术前，经过超声测量CRL确定孕周，超声检查见原始心管搏动证实胎儿存活，既往无高血压病、糖尿病、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病，无子痫前期病史，本次妊娠无停经后异常阴道流血、无发热及其他异常。将绒毛组织置于常温PBS溶液中，快速带回实验室，2小时内进行绒毛组织培养。子痫前期患者胎盘、正常妊娠足月胎盘取自2012年7月至2012年12月在奥克兰大学附属医院妇产科分娩孕妇。子痫前期患者血清及相同孕周、正常对照组孕妇血清取自分娩前约10ml。2．方法2．I血液、胎盘标本收集及处理 万方数据复旦大学硕士学位论文孕妇血清标本采集：经肘静脉采集妊娠32周前静脉血10ml，其中早发型子痫前期孕妇分娩前，血标本14例，正常妊娠孕妇分娩前，血标本14例，分别注入不加抗凝剂的无菌试管中。室温静置4h后，以1500xg离心10分钟，吸取试管内上层血清lml分装于EP管中，保存于．80℃低温冰箱。胎盘标本的收集：子痫前期孕妇胎盘6例，正常妊娠胎盘6例。待胎盘娩出后，立即从胎盘母体面脐带根部取材，取胎盘组织约2cm×2cm×2cm大小，快速在PBS中清洗3次，放入EP管中，快速带回实验室，2小时内进行胎盘组织培养。2．2细胞培养人微血管内皮细胞HMEC．1购自美国国家传染性疾病中心，U937细胞(人单核细胞)购自Invitrogen公司。HMEC．1在37。C，5％C02条件下培养于含10％胎牛血清的MCDBl31培养液中，U937细胞在37℃，5％C02条件下培养于含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液中。HMEC．1和HPAEC都以0．25％胰酶溶液+1mMEDTA溶液消化、传代，5—6天传代1次。HMEC．1以8术104／mi的浓度种于96孔板或12孔板中，在37℃，5％C02恒温箱中培养。①在超净台内，倒出T25细胞培养瓶中的培养液，加入10ml室温、无菌PBS轻柔冲洗一遍，以洗去漂浮的死细胞。②向培养瓶中加入2ml的胰酶，放置恒温细胞培养箱内孵育3．5分钟，待细胞漂浮后加入MCDBl31培养液10ml终止胰酶的消化作用，10ml移液器均匀吹打贴于瓶壁的细胞，使其悬浮于培养液中，将细胞悬液转到25ml离心管中，3000转／分，离心5分钟。⑧弃去上清液，加入适量MCDB131培养液，进行细胞计数，然后加培养液稀释至8木104／mi种于96孔板或12孔板中。④在96孔板上，每孔100ul，或12孔板，每孔lml，放入恒温细胞培养箱培养一天，待细胞长满后，进一步处理。2．3培养早孕绒毛组织和收集脱落滋养细胞①收集正常孕妇早孕绒毛组织，用1*PBS清洗2．3次，去除绒毛组织上的血块及蜕膜，保留绒毛组织。②切割绒毛组织，每块湿重大约400mg。③将直径约10mm、底部为网状孔(直径400um)的圆柱形容器NetwellTM放置于12孔板中，然后将切割好的绒毛组织转移入NetwellTM内。④向上述孔中加入含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液3ml，轻轻晃动，使绒毛组织充分漂浮于培养液中，盖上盖子，透气封条封闭12孔板，放于37℃、5％C02培养箱中培养24h。 万方数据复旦大学硕士学位论文⑤24小时后，在显微镜下观察，12孔细胞培养板底部可见脱落滋养细胞、红细胞、白细胞等。确认无霉菌、细菌等感染后，在超净台内，将绒毛组织转移至5ml无菌试管中，立即放于．80℃冰箱保存。无菌镊子取出Netwell，显微镜下再次观察脱落滋养细胞。用lml移液器，反复吹打培养板底部，使脱落滋养细胞悬浮于细胞培养液中，将每3个孔中的细胞悬液转移至一只15ml离心管中，细胞悬液在20℃、15009条件下离心5分钟，将上清转移至新的无菌离心管中，待进一步收集STBM。⑥裂解红细胞：向上述细胞沉淀中加入9ml无菌蒸馏水，混匀，静置1分钟。⑦去除红细胞碎片：加入lO*PBS1ml，混匀，使细胞悬液恢复为平衡溶液，在20℃、3000rpm／min条件下离心5分钟，弃上清。⑧去除白细胞：向上述细胞沉淀中加入lmlCD45+白细胞抗体磁珠稀释液(CD45+磁珠和1*PBS按1：100稀释)，混匀，室温静置30分钟。将上述细胞悬液转移至1．5mlEppendorf管中，并放置于DynalMPC(MagneticParticleConcentrator)磁吸附器上回收磁珠，室温静止3分钟，使CD45+磁珠．白细胞吸附于Eppendorf管靠近仪器的管壁上。⑨缓慢吸出含脱落滋养细胞的悬液，80009离心5分钟，弃上清，即得到滋养细胞节(TD)。经过cytokeratin和vimentin免疫染色证实。每管加入8009lMCDBl31培养液，用于处理HMEC．1细胞，或做细胞涂片进一步用于免疫荧光实验。早孕绒毛组织分别用10％FBS，10％子痫前期患者血清，10％相同孕周、正常孕妇血清培养。子痫前期患者胎盘和足月正常孕妇胎盘的培养和脱落滋养细胞的收集同上。部分10％FBS培养的脱落滋养细胞放置．20℃冰箱2小时以上，使其发生坏死改变，即NTD(necrosistrophoblastdebris)。2．4不同来源的TD与HMEC．1共培养。子痫前期患者胎盘来源的TD；未经处理的(10％FBS)早孕期绒毛来源的TD；经子痫前期患者血清处理的TD；经相同孕周、正常孕妇血清处理的TD分别用于处理单层HMEC．1，共培养24h。经过处理的HMEC．1用于检测血管内皮细胞对TD的反应。另有部分实验，HMEC．1细胞用重组IL．113处理，进一步检测内皮细胞是否被激活。接种于12孔板或96孔板中的HMEC．1细胞培养至对数生长期后，用微量移液器吸出原培养液，1*PBS洗2次后，分别加入上述不同来源的TD，12孔板每孔加入800ul滋养细胞悬液，96孔板每孔加入lOOul滋养细胞悬液，37℃，5％C02条件下培养24h。2．5基于细胞的ELISA法检测HMEC．1表面ICAM．1的表达 复旦大学硕士学位论文①微量移液器轻轻吸取96孔板上清液，避免划破单层HMEC．1细胞②洗涤：无菌l*PBS洗涤3次③加入鼠抗ICAM．1单克隆抗体，即CD54抗体，CD54抗体用MCDBl31以1：100稀释，每孔加入稀释液100ul，37℃，5％C02条件下孵育2．3h。④洗涤：无菌1*PBS洗涤3次。⑤二抗：加入生物素连接抗鼠二抗稀释液(1：2000)，每孔lOOul，37℃，5％C02条件下孵育1．2h。⑥洗涤：无菌1*PBS洗涤3次。⑦三抗：加入链霉亲和素连接辣根过氧化酶(HRP)稀释液(1：2000)：每孔100ul，37℃，5％C02条件下孵育1h。⑧洗涤：无菌1*PBS洗涤三遍。⑨此步骤起，需避光操作。加入辣根过氧化酶(HRP)的作用底物领苯二胺(OPD)，缓冲液以1mg／mIOPD+0．4ul／mlH202的浓度配制，每孔100ul。⑩加入OPD后，根据颜色反应适时终止反应，终止液10％的盐酸，每孔50ul。波长490nm读数，并分析结果。2．6U937粘附实验检测HMEC．1的激活①微量移液器轻轻吸取96孔板上清液，避免划破单层HMEC．1细胞②洗涤：无菌l*PBS洗涤3次zkq20160222③以下操作需避光。将事先用细胞示踪剂CMTPX(Red)标记的U937单核细胞悬液加入HMEC．1细胞中，37。C，5％C02条件下孵育3h。④洗涤：无菌1*PBS洗涤3次，将未粘附的U937移除。⑤读数：Synergie2，BioTek，荧光读数，波长545nm测定U937的粘附量。未用滋养细胞节处理的HMEC．1细胞表面粘附U937的量作为对照，计算实验组与对照组的U937细胞粘附比例。2．7裂解脱落滋养细胞节①样本准备：子痫前期胎盘来源的TD、正常妊娠对照组胎盘来源的TD、分别用子痫前期患者血清和相同孕周、正常对照组处理早孕期绒毛组织来源的TD放置于冰上。②在冰上向上述样本中加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液1ml，冰上放置30min(摇床轻摇)。然后用微量加样器将样品转移至1．5ml离心管。4"C，12000rpm／min条件下离心20rain。将上清转移至干净无菌Eppendorf管中，．80℃冰箱保存或蛋白定量(空白对照采用RIPA)。2．8裂解产物蛋白定量①根据样品数量，按50体积SolutionA+l体积SolutionB配制适量BCA工作万方数据 复旦大学硕士学位论文液，混匀后使用。@BSA标准品和样品的准备：取适量蛋白标准BSA，稀释至终浓度0．25ug／ml。适当稀释样品，使待测定的浓度位于标准曲线的线性区域。根据标准品的浓度确定各样本的具体浓度。在96孔板中按下表的次序加入BSA标准或样品及BCA工作液，混匀。⑨保温：37*C放置20．30min；也可以室温放置2小时。④保温结束后，取出96孔板，冷却至室温。⑤测OD值：测定波长562nm的光吸收值。⑥绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。样品浓度=吸光度X浓度系数。2．9Westernblot检测pro．caspase．1、activecaspase．1表达①制备SDS凝胶：玻璃板清洗干净后对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。按前面方法配11％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，一定要沿玻璃板流下，以免产生气泡，待胶面升到距顶端2cm高度时即可。然后在胶面上缓慢加一层异丙醇，使胶面压平。当异丙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶己凝固，倒去胶上层异丙醇，水流轻轻冲洗，并用滤纸将水吸干。按前面方法配4％浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入，待胶凝固。zkq20160222②上样：根据蛋白定量结果，计算相同蛋白量所需的每个样品体积，加入5×蛋白上样缓冲液至终浓度为1x，煮沸5．10min使蛋白变性。浓缩胶凝固后，把胶放入电泳槽，加足够的电泳液，小心垂直拔出梳子后，开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，注意不要吸进气泡，将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。③电泳：浓缩胶电压60V，分离胶电压120V，约2．3h。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。④转膜：制作转膜“三明治”时，注意正负极正确放置，黑色为负极，红色为正极，蛋白带负电荷从负极向正极移动，所以，顺序依次为：红色夹板、海绵2层、膜(剪去右上角作为正面标记)、蛋白胶、海绵、黑色夹板。放入转膜槽时，黑面对黑面，红面对红面。在转膜槽中放入冰块降温，接通电源，100V转膜60min。转膜时间视目的蛋白分子量大小决定。⑤丽春红染色：转膜完成后，将NC膜在盛有少量水的平皿中轻轻漂洗一次，然后用丽春红染色5．10min，可见蛋白条带，用l*PBS彻底洗去丽春红S。(此步可省略)⑥封闭：将膜用PBS浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下摇床轻摇封万方数据 复旦大学硕士学位论文闭1h：⑦免疫反应：根据需要裁剪NC膜，用一抗稀释液稀释抗体(mouseanti-humancaspase．11．1000)，4"C摇床轻摇孵育过夜。PBST洗涤5minx6次。把NC膜放入用PBST按1：5000稀释的二抗液中(horseradishperoxidaseconjugated—goatantimousesecondaryantibody1：5000)，室温摇床轻摇孵育1．2h。TBST洗涤5rain×6次。⑧化学发光：此步骤起开始避光操作。将ECL发光液A和B两种试剂等体积混合后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；反应1-2rain后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好。⑨曝光、扫膜：根据信号的强弱适当调整曝光时间，曝光完成后，拍照。进行结果分析。2．11冰冻切片①实验开始前，打开恒温冰冻切片机预冷，设置冰室温度。②包埋：从-80℃冰箱取出经10％FBS、10％子痫前期患者血清、10％正常孕妇血清处理的绒毛组织。样品托上涂一层OCT包埋胶，将冷冻组织置于其上，四周涂OCT包埋胶，以完全覆盖为宜，避免产生气泡。放于速冻台上5分钟，使样品固定于样品托上。③切片：低温室内温度．20℃，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置和角度要zkq20160222适当，刀片温度．18℃，切片厚度51．tm，载玻片附贴组织切片时不能上下移动，用铅笔表示切片名称。切好室温放置30min使其自然干燥，锡箔纸包裹切片，放于-80℃冰箱保存。2．12脱落滋养细胞节涂片①收集新鲜的经上述不同处理的脱落滋养细胞用100ulPBS稀释混匀②每个载玻片上滴加约20ul脱落滋养细胞悬液，轻柔、均匀涂片于载玻片上，室温、超净台内晾干。锡箔纸包裹细胞涂片，放于．80℃冰箱保存。2．13免疫荧光染色(caspase．1)①配置4％多聚甲醛，放于4℃冰箱预冷20分钟。②将滋养细胞节涂片、早孕绒毛组织切片用记号笔标记出待染色区域。③用预冷的4％多聚甲醛固定细胞或组织10分钟。PBS洗三遍，每次5分钟。④2％BSA封闭30分钟，PBS洗两遍。⑤加入1抗(mouseanti．humancaspase．11：20，10％NGS稀释)，室温孵育3小时。PBS洗三遍，每次5分钟。⑥加入二抗(rabbitanti．mousebiotinlatedIgG1：1000，lO％NGS稀释)，室温孵育1小时。PBS洗三遍，每次5分钟。万方数据 复旦大学硕士学位论文⑦加入荧光染料(此步骤起，需避光操作)，室温孵育l小时。PBS洗三遍，每次5分钟。⑧加入hoechst(1：100，10％NGS稀释)染色30分钟PBS洗三遍，每次5分钟。@anti．fading封片剂封片，用盖玻片覆盖染色组织。⑩荧光显微镜观察caspase．1表达情况，激光共聚焦显微镜拍照。2．14统计方法所有实验均重复至少三次。结果用中位数±标准差、95％可信区间表示，比较实验组与对照组检测指标倍数的变化是否有统计学差异。用Prism软件ANOVA或Mann-WhitneyU一检验进行统计分析，p<0．05有统计学意义。3结果3．1子痫前期患者及正常对照组临床信息子痫前期组的收缩压和舒张压均明显高于正常妊娠组，子痫前期组与正常妊娠组的母亲年龄差异无统计学意义(P>O．05)，采集血液样本的孕周，子痫前期和正常妊娠组差异无统计学意义(P>0．05)。表1：取血清标本的子痫前期患者和正常对照组孕妇临床信息。zkq20160222子痫前期患者(N=14)正常孕妇(N=14)P值母亲年龄32．5(16-46)33．5(18-43)P>0．05取样孕周26(17-26)26+2(23．31+4)P>O．05收缩压(mm．Hg)160(140·184)<140P+++P++>++>++o—oc卜O0O旧O鲫砌的幻一一暑-、窆一口l_．J一-o卫o>o—D工卜 万方数据复旦大学硕士学位论文C．殳拨ok△×山■主《芏-o山u’巾aJb．c可石“Figure5C子重组人IL．1B处理血管内皮细胞，内皮细胞发生活化，ICAM一1表达明显升高。fP<0．05)3．5pro．caspase．1，caspase．1参与调节子痫前期患者胎盘来源的和经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节IL．1B表达水平的升高。与其他细胞因子不同，IL．1B的分泌分为两步：首先，固有免疫信号诱导pro．IL．1D的表达。然后pro．caspase．1被剪切为有活性形式并分泌，这一过程由炎症小体介导。炎症小体形成后，caspase．1被激活，后者进一步剪切pro．caspase．1p为成熟的IL．1p并分泌至胞外[501。为了研究滋养细胞节IL．1p表达升高是否与caspase．1通路有关，我们通过westernblot检测了滋养细胞节pro—caspase．1和activecaspase．1的表达。我们发现子痫前期患者胎盘来源的和经予痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节IL．1D表达水平明显升高。蔓㈡烈=三e—U¨{塞默paSpⅪn蹦m．量a^．，引C“孙一、叫一帆m∞吼p 万方数据复旦大学硕士学位论文Figure6Bp=U．UZIl13=0．01TlIT广—-l门。母。日_Co‘，侣△‘’_Q∞E仃UoIX,ro—caSpase一1o∞CDo噶△U墨△仂E啊‘，oLIX,ActivecasDase．1Figure6A—B子痫前期患者胎盘绒毛组织来源的滋养细胞节pro—caspase-l，activecaspase·1表达水平与正常妊娠对照组相比明显升高。Figure6C15nFigure6D’孽濑醪獬《糍，。Pro-caspase-1active··caspase·-1ij■■嘲嘲滞擘孥嘲擎黪鬻p-actin28505010c一芑∞。吐o_o>=侣一o．I》总∞coo∞眄_Coo懵一Qo>一∞cm_OE．10Zcou毋一△o>一∞co_oE—IOZf 万方数据复旦大学硕士学位论文400300200t000Pro—caspase一1Activecaspase-1Figure6C．D经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节pro-caspase。1，activecaspase．1表达水平与相同孕周、正常孕妇血清处理组相比明显升高。3．6免疫荧光染色进一步证实caspase．1在子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节中表达明显增加。29uI芍幅．皿o_o^l_日Ia-扫Iscoo罡o∞o筝aE眄13D巴厶g心∞o>一协co_OEkOZ懵Lo∞o；口E曙一u口小’Jt嵋．Io∞o>-协Co_oPC-oZ 万方数据复旦大学硕士学位论文Figure7A正常孕妇血清处理绒毛组织来源的滋养细胞节。B子痫前期患者血清处理绒毛组织来源的滋养细胞节。C正常孕妇血清处理绒毛组织，D子痫前期患者血清处理绒毛组织。4讨论血管内皮细胞损伤是子痫前期主要的基本病变，血管内皮细胞受损和系统性炎症反应可引起血管痉挛，全身小动脉痉挛诱发血压上升[211。血管内皮细胞损伤发生在出现子痫前期临床症状之前。由于子痫前期仅仅发生于妊娠或滋养细胞肿瘤患者，并且胎盘的娩出是唯一有效的缓解子痫前期症状的方法，所以胎盘释放的某些因子被认为是引起血管内皮细胞系统的激活和系统系炎症反应的重要原因恒1|。然而，胎盘的某些因子激活血管内皮细胞的机制尚不清楚。我们前期研究发现，其中一个因素是脱落滋养细胞。正常胎盘脱落的滋养细胞节在母体血液循环中可以被内皮细胞吞噬，由于其性质为凋亡，所以不会诱发血管内皮细胞激活。但是在子痫前期病人，其胎盘产生过量的坏死(或凋亡／坏死)滋养细胞节，并随子宫静脉进入母体循环系统，被血管内皮细胞吞噬后，会诱导血管内皮细胞激活p2I。但是，迄今为止，没有直接的证据证明子痫前期患者胎盘脱落的 万方数据复旦大学硕士学位论文滋养细胞节是坏死性质。本课题研究发现，血管内皮细胞吞噬子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节后被激活，提示子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节为坏死性质。进一步将子痫前期患者分为早发型和晚发型子痫前期，我们发现早发型和晚发型子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节均可诱发血管内皮细胞的激活，提示了与正常妊娠相比，子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节更倾向于是坏死或凋亡．坏死的性质，并且不受子痫前期发病早晚的影响。本课题的局限性是，虽然我们未能取得与早发型子痫前期患者相应孕周的正常孕妇胎盘作为对照研究，我们选用了足月正常胎盘作为对照。众所周知，很难获得与早发型子痫前期患者相同孕周、正常孕妇胎盘。但是我们发现，和正常足月胎盘相比，来自于晚发型子痫前期胎盘的滋养细胞诱发血管内皮细胞功能异常。同时我们的实验结果发现早发型和晚发型子痫前期胎盘脱落的滋养细胞节均可诱发血管内皮细胞的激活，因此，有理由相信我们的研究结果在早发型和晚发型子痫前期患者均是有效的。诱发子痫前期患者胎盘产生更多的坏死或凋亡／坏死性质的脱落滋养细胞节的机制尚不清楚。目前，被广为接受的理论是，绒毛外滋养细胞侵袭不足导致子宫螺旋动脉重铸不良，造成胎盘的缺血缺氧状态，或者导致合体滋养层细胞缺氧．再灌注损伤。胎盘进一步释放有害因子激活母体血管内皮细胞系统和免疫系统。但是，并非所有子痫前期患者表现出子宫血流灌注下降【5引，提示了子宫螺旋动脉重铸不良并不是所有子痫前期患者的初始病因。可能的原因是子痫前期患者胎盘中存在的内在缺陷导致了胎盘释放有害因子。我们的研究发现，在氧气充分的条件下，子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节为坏死性质，提示了胎盘的一些内在缺陷可能导致了脱落的滋养细胞节为坏死性质。本研究也提示了子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节包含某些危险因子，可激活血管内皮细胞。在本研究中，分别用子痫前期患者血清和相同孕周的正常孕妇血清培养早孕期绒毛组织，我们发现子痫前期患者血清培养早孕期绒毛组织获得的滋养细胞节能诱发血管内皮细胞的激活，提示了子痫前期患者血清中存在某些因子可以促使胎盘生成坏死的滋养细胞节。在脱离子宫微环境的情况下，子痫前期患者血清中的因子足以诱发正常胎盘释放坏死性质的脱落滋养细胞节。我们前期研究发现氧浓度并不能诱发过量的坏死性质的脱落滋养细胞节生成【541，以上研究提示氧浓度并不是导致胎盘损伤释放坏死性质的脱落滋养细胞节的关键环节。尽管，子痫前期的临床症状一般出现于孕20周以后，但是母体血管内皮细胞功能障碍早于临床症状出现前数周，因此，诱发子痫前期的胎盘有毒因子的生成也一定发生于妊娠20周以前。本课题发现了子痫前期患者血清可以改变从早孕绒毛组织脱落的滋养细胞节的生物学性质，从而激活血管内皮细胞(提示滋养细胞节转变为坏死性质)。我们前期研究发现在一些子痫前期患者血清中升高的 万方数据复旦大学硕士学位论文细胞因子IL．6，TGF[31和抗磷脂抗体(antiphospholipidantibodies，aPL)可以诱导正常早孕绒毛组织生成坏死性质的滋养细胞节【4‘7，4引。然而，并非所有的子痫前期患者血清中都出现这些因子，本课题所研究的子痫前期患者可能很少有抗磷脂抗体阳性，本研究中包含的子瘸前期患者血清中的IL．6和TGFpI水平与正常妊娠相比明显升蒯55】。可能是IL．6或TGFl31或者两种因子的联合作用诱发了滋养细胞节生物学性质的改变，但是由于子痫前期患者血清中可能包含很多因素，所以具体是哪些因子诱发血管内皮细胞功能异常还有待以后进一步研究。我们前期的研究证实，正常妊娠胎盘来源的脱落滋养细胞节是以凋亡的途径生成，血管内皮细胞对凋亡性质的滋养细胞节和坏死性质的滋养细胞节的反应不同1521，血管内皮细胞通过何种途径区分凋亡性质和坏死性质的滋养细胞节的机制尚不清楚。我们认为可能与坏死性质的滋养细胞节所携带的炎症信号(危险)与血管内皮细胞的相应受体相互作用，从而诱发血管内皮细胞的激活有关。我们研究证实了。，子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节和经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞节中促炎症细胞因子IL．1D明显升高。IL．113的大量生成可以导致组织损伤和病理改型56J。IL．113也可出现在其他细胞类型的细胞碎片中，并且诱发血管内皮细胞的激活[57-60]。比如单核细胞碎片中升高的1L．1D可以诱发血管内皮细胞的激活。另外早孕期滋养细胞在尿酸和抗磷脂抗体的刺激下，可通过炎症小体NALP3／ASC活化caspase．1，后者将pro．IL．1B剪切为成熟的IL．1D，导致促炎症细胞因子lL．1p表达增加【6l，62J。我们进一步研究发现，子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节和经子痫前期患者血清处理的正常早孕绒毛组织来源的滋养细胞节中pro．caspase．1和activecaspase．1的表达均明显升高，说明了滋养细胞节中IL．1p升高的分子机制。免疫荧光染色发现，经子痫前期患者血清处理的正常早孕绒毛组织中合体滋养层细胞caspase．1活性明显增加，提示1L．113的生成开始于合体滋养细胞生成滋养细胞节之前。综上所述，我们的研究提示子痫前期患者血清中的某些因子和胎盘内在因素诱导合体滋养细胞和滋养细胞节中caspase．1的活化，后者促进IL．1D的生成和分泌，滋养细胞节携带IL．16与血管内皮细胞的相应受体相互作用，从而激活了血管内皮细胞，表现为细胞表面ICAM．1表达升高，单核细胞粘附增加，IL．6和TGFl31分泌等。虽然，我们证明了子痫前期患者胎盘脱落滋养细胞节中升高的IL．1D可能是激活血管内皮细胞一个因素，但是我们相信IL．1D并不是子痫前期患者胎盘中引起血管内皮细胞激活的唯一因素，其他可能参与血管内皮细胞激活的细胞因子有待进一步研究。总之，我们发现了子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节是坏死性质的，可以激活血管内皮细胞，并且与子痫前期的发病早晚无关。子痫前期患者血清在 万方数据复旦大学硕士学位论文氧气充足的条件下，可以促使早孕期正常绒毛组织生成坏死性质的滋养细胞节并激活血管内皮细胞。子痫前期患者胎盘来源和经子痫前期患者血清处理的脱落滋养细胞节中升高的炎症因子IL．113可能与血管内皮细胞系统的激活有关。第二部分：脱落滋养细胞微颗粒在子痫前期发病机制中的作用：激活血管内皮细胞1．材料细胞示踪剂CMFDA(green)Invitrogen(Auckland)Inhibitorofcaspase一1，AC—YVAD-CMKwaspurchasedfromSigma(Auckland)余同第一部分。2．方法2．1血液、胎盘标本收集及处理同第一部分2．2细胞培养同第一部分；2．3STBM的收集：第一部分2．3步骤⑤培养早孕绒毛组织经15009离心，收集TD后取得的上清液，在75，0009条件下离心20rain，弃上清，得到STBM。经免疫组化染色证实cytokeratin阳性，CD45和vimentin阴性。2．4HMEC．1细胞吞噬STBM的检测@HMEC．1以2．5xl0s种植于6孔板内的无菌盖玻片上(Biolab)②待盖玻片上细胞长满时，用细胞示踪齐lJlgmol／LCMFDA(green)370Cand5％C02孵育2d,时。③将提前用CMTPX(red)标记的STBM加入上述单层内皮细胞，空白对照组不加STBM。@24h后，吸出培养液，1*PBS洗3次后，用4％多聚甲醛固定，盖玻片用Citiflour(AqarScientific)粘附在载玻片上，避免产生气泡。用LeicaTCSSP2激光共聚焦显微镜观察细胞。另外，为了检测HMEC．1对STBMfl4J吞噬能力，HMEC．1细胞以104／ml的浓度种于96F1。板中，待细胞生长至对数期，将提前用CMTPX(red)标记的STBM力[I入单层内皮细胞，分别在0．5h、1h、2h、4h、24h后，用1*PBS洗涤4次，以去除HMEC．1细胞表面未被吞噬的STBM，用Synergie2检测STBM的荧光强度，作为对照，一些HMEC．1细胞，在用STBM处理前，先用吞噬抑制剂c”ochalasinD 万方数据复旦大学硕士学位论文(10Ltg／m1)处理2h。2．5HMEC．1细胞清除STBM的检测HMEC．1细胞以104／m1种植于96孔板，待细胞长满后，将提前用CMTPX(red)标记的STBM加入上述单层内皮细胞孵育4h。用1*PBS洗涤4次，以去除HMEC．1细胞表面未被吞噬的STBM，HMEC．1细胞继续培养48小时，分别在17h、24h、48h，用Synergie2检测STBM的荧光强度。2．6不同来源的STBM处理HMEC．1细胞、条件培养液的收集，同第一部分。2．7基于细胞的ELISA检测HMEC．1细胞表面ICAM．1的表达，同第一部分。2．8ELISA法测条件培养液中IL．113的表达水平。①抗体包被：用1*PBS按1：250比例稀释包被抗体，每个孑L(96孔板)加入100ul的抗体稀释液，4。C过夜。②洗涤：取出96孔板，室温放置30分钟，每孔加入400ulPBST洗涤，共3次，每次3分钟。③加入待测样本：在96孔板上设置空白对照孔(此孔不加样本，以标准稀释液代替)、待测样品孔和标准品孔；将标准品、样本按设定的孔分别加样，每孔50ul，每份样品做两孔，加样时注意将样本加于酶标板底部，尽量不触及孑L壁，不产生泡沫。加样后以封口膜封上，室温静置2h。④洗板、拍板：2h后将各孔里的液体吸出，加满洗涤液，静置3min，倒出洗涤液后再重复加入4次，洗涤结束后，用滤纸包好拍板。⑤加酶标抗体：除空白对照空外，其余每孔依次加入100ul的酶标抗体(Anti．RabbitIL．1BHRP)，封口后，室温静置2小时。⑥洗板、拍板：重复上面洗板过程4次。⑦加底物：每个孔按顺序依次加入显色液100ul，室温避光反应(液体将由无色透明变为蓝色)⑧终止反应各反应孔中加入终止液lO％H2S04溶液50ul终止反应，充分混合，待液体由蓝色转为黄色。⑨测OD值：于波长450nm处，以空白对照孔调零，然后检测各孔OD值，根据标准曲线的OD值换算待测样品中IL．113含量。2．9统计方法：同第一部分。3．结果3．1血管内皮细胞可以吞噬、清除滋养细胞微颗粒。我们前期研究发现，血管内皮细胞可以脱落吞噬滋养细胞(TD)，为了研究34 万方数据复旦大学硕士学位论文血管内皮细胞是否能吞噬滋养细胞微颗粒，我们将事先用细胞示踪剂标记的滋养细胞微颗粒和单层血管内皮细胞HMEC．1共培养，作为对照，部分实验中加入吞噬抑制剂cytochalasinD，培养4h、17h、24h后，采用激光共聚焦显微镜观察，血管内皮细胞是否吞噬了滋养细胞微颗粒。吞噬滋养细胞的数量用荧光分析仪检测。我们发现，血管内皮细胞可以吞噬滋养细胞微颗粒，并随着时间的延长，吞噬量增加。为了进一步研究血管内皮细胞是否可以吸收或清除吞噬的滋养细胞微颗粒，去除未被吞噬的滋养细胞微颗粒后，吞噬了滋养细胞微颗粒的血管内皮细胞继续培养48h。然后再次用荧光分析仪检测己吞噬滋养细胞微颗粒后的血管内皮细胞，发现随着时间的延长，血管内皮细胞内滋养细胞微颗粒释放的荧光量逐渐下降。FigureIAGreen：HMEC-1，Red：STBM(arrows)激光共聚焦成像显示，血管内皮细胞可以吞噬滋养细胞微颗粒。jFigureIB血管内皮细胞吞噬滋养细胞微颗粒的能力在吞噬抑制剂(cytochalsinD)存在的情 万方数据复旦大学硕士学位论文况下明显减弱。3IJ【11111‘caredfJ5hh2114h24hFigureIC随着时间的延长，血管内皮细胞吞噬滋养细胞微颗粒的量增加。3．2血管内皮细胞吞噬子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒后，发生活化。为了研究子痫前期患者血清是否能促进“坏死”的滋养细胞微颗粒的产生，早孕期绒毛组织培养于含lO％子痫前期患者的培养液中，培养于含10％相同孕周、正常孕妇血清的早孕绒毛组织作为对照组。收集的STBM用于处理单层血管内皮细胞HMEC．1，HMEC．1吞噬子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的STBM后，细胞表面表达ICAM．1明显升高。p=0001Figure2子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒可以激活血管内皮细胞(p<0．05)，而相同孕周、正常孕妇血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒不能激活血管内皮细胞。3．3血管内皮细胞吞噬子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微361_．、_，-，—¨U，=毋暑o-=一‘’o=o：，∽—_．II'：一‘．-o’’∽嚣。L：'=一I，一o‘4321Oco一∞nQ．IQxQr．：《U一|Ioo∞再o．Iuc一廿一oL 万方数据复旦大学硕士学位论文颗粒后，几．1B分泌水平升高。为了研究STBM引起血管内皮细胞的激活的可能机制，我们检测了经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的STBM和吞噬了STBM的HMEC．1的条件培养液中IL．113的水平。子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的STBM中未检测到IL．113的表达；然吞噬了经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的和子痫前期胎盘来源的STBM的HMEC．1条件培养液中IL．113的水平明显升高。!p=0．001厂—————]Figure3吞噬了子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒的血管内皮细胞分泌几一lp的量明显升高。4．讨论在正常妊娠中，从胎盘合体滋养层细胞表面生成并释放滋养细胞微颗粒进入母体外周血液循环，滋养细胞微颗粒在调节母体免疫功能以及正常妊娠的维持中发挥重要作用口6I。在子痫前期患者，由于胎盘脱落滋养细胞的数量增加，外周循环中滋养细胞微颗粒的量也随之增加【631，由于滋养细胞微颗粒可以调节免疫反应，引起血管内皮细胞激活，这些可能是子痫前期患者过度的炎症反应的原因之一I川，同时滋养细胞微颗粒可抑制内皮细胞的增殖[26】，诱导内皮细胞凋亡增加【65|。单核细胞和B细胞可结合并吞噬滋养细胞微颗粒(STBM)，释放炎症细胞因子，我们前期研究发现血管内皮细胞可吞噬清除滋养细胞节，血管内皮细胞是否能吞噬清除滋养细胞微颗粒尚不清楚。滋养细胞节大部分被阻滞于肺毛细血管，而滋养细胞微颗粒较小，可大量进入外周血液循环，直接与外周血管内皮细胞发生相互作用，可能也是引起子痫前期患者血管内皮损伤的一个重要因素[261。胎盘可以生产大小不等的脱落滋养细胞，不同大小的脱落滋养细胞可能会有≈7一一I-c，5△一再_。Qr．J一-o一-，o—oc卜 万方数据复旦大学硕士学位论文不同的生物学功能，为了获得相对单一的滋养细胞微颗粒，我们通过分段离心方法去除较大的滋养细胞节和单个核滋养细胞，最后获得滋养细胞微颗粒。为了研究血管内皮细能否吞噬清除滋养细胞微颗粒，我们将事先用细胞示踪剂标记的滋养细胞微颗粒和单层血管内皮细胞HMEC．1共培养，作为对照，部分实验中加入吞噬抑制剂cytochalasinD，培养4h、l7h、24h后，采用激光共聚焦显微镜观察，血管内皮细胞是否吞噬了滋养细胞微颗粒。我们发现了，血管内皮细胞可以吞噬滋养细胞微颗粒，并随着时间的延长，吞噬量增加。为了进一步研究血管内皮细胞是否可以吸收或清除吞噬的滋养细胞微颗粒，去除未被吞噬的滋养细胞微颗粒后，吞噬了滋养细胞微颗粒的血管内皮细胞继续培养48h。然后再次用荧光分析仪检测己吞噬滋养细胞微颗粒后的血管内皮细胞，发现随着时间的延长，血管内皮细胞内滋养细胞微颗粒释放的荧光量逐渐下降。这些结果表明血管内皮细胞在吞噬滋养细胞微颗粒后可以消化滋养细胞微颗粒。为了研究来自于子痫前期胎盘的滋养细胞微颗粒是否可以诱发血管内皮细胞功能异常，我们将血管内皮细胞和来自于子痫前期胎盘的滋养细胞微颗粒共培养，我们发现血管内皮细胞功能异常的指标ICAM．1和U937单核细胞粘附能力上升。同时我们还发现经子痫前期患者血清处理的正常早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒也可以激活血管内皮细胞，提示异常的滋养细胞微颗粒可以诱发血管内皮细胞功能异常。有趣的是，血管内皮细胞和不同的滋养细胞微颗粒共培养后，血管内皮细胞分泌炎症细胞因子IL．1D。IL．1D的大量生成可以导致组织损伤和病理改变，我们的实验还证明IL．1D重组蛋白可以诱发血管内皮细胞功能异常。说明IL．1B在诱发血管内皮细胞功能异常中发挥重要的作用。其他研究者发现，滋养细胞微颗粒可与单核细胞和B细胞结合，并被吞噬，提示了单核细胞和B细胞表面的受体参与了结合和吞噬滋养细胞微颗粒的过程，但是哪些受体参与了这个过程还不清楚p引。血管内皮细胞表面参与结合和吞噬滋养细胞微颗粒的受体和分子机制还有待进一步研究。子痫前期患者外周循环中，滋养细胞微颗粒数量的增加可诱发血管内皮细胞的损伤和母体循环中自细胞如单核细胞、中性粒细胞、NK细胞和树突细胞的激活，单核细胞参与了促炎症细胞因子的分泌，导致母体持续的炎症反应状态，中性粒细胞在滋养细胞微颗粒和缺氧诱导的炎症反应中被激活，NET(neutrophilextracellulartrap，中性粒细胞细胞外网)和活性氧物质生成增加、弹性蛋白酶活化等导致血管损伤，外周阻力升高两】。另外有研究发现子痫前期患者外周血液循环中的升高的sFlt．1蛋白水平，25％归功于脱落滋养细胞微颗粒(STBM)所携带的sFIt．1i67|。sFlt．1可与血管生长因子如VEGF和PIGF结合，并阻断后者在维持正常的血管内皮细胞功能和促进血管生成中所发挥的作用，从而介导血管损 万方数据复旦大学硕士学位论文伤或影响血管生成【23】。sFlt．1水平在子痫前期患者血清中明显升高，并且先于临床症状的出现，其升高程度与子痫前期的严重程度有关，抑制新血管的生成，导致内皮细胞功能障碍、高血压、蛋白尿等【68’70】。缺氧环境中培养的、滋养细胞系来源的脱落滋养细胞碎片(STBM)与PBMC共培养后，PBMC表达白细胞介素-6(IL．6)，肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactoralpha,TNFct)增加17¨，胎盘局部IL-6的增加可诱导局部从固有免疫向适应性免疫的转化，进一步影响滋养细胞的侵袭和脱落【72】。来源于子痫前期患者滋养细胞微颗粒(STBM)可刺激白细胞产生超氧阴离子自由基【73I。我们进～步研究滋养细胞微颗粒(STBM)对血管内皮细胞功能的影响，采用不同来源的滋养细胞微颗粒(STBM)处理单层血管内皮细胞，我们发现经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒(STBM)可诱发血管内皮细胞的活化，细胞间粘附分子表达升高。总之，我们发现了血管内皮细胞可以时间依赖方式吞噬并清除滋养细胞微颗粒，子痫前期患者血清处理的正常早孕绒毛组织来源的滋养细胞微颗粒可激活血管内皮细胞，表现为血管内皮细胞表面ICAM．1表达上升，条件培养液中也．1D分泌增加，提示子痫前期患者胎盘来源滋养细胞微颗粒与血管内皮细胞系统的激活有关。结论子痫前期患者胎盘来源的脱落滋养细胞节可以激活血管内皮细胞，并且与子痫前期的发病早晚无关，提示了子痫前期患者胎盘脱落的滋养细胞节是坏死性质的。子痫前期患者血清在氧气充足的条件下，可以促使早孕期正常绒毛组织生成坏死性质的滋养细胞节并激活血管内皮细胞。子痫前期患者胎盘来源和经子痫前期患者血清处理的早孕绒毛组织来源的脱落滋养细胞节中炎症因子IL．113的升高与caspase．1通路激活相关。脱落滋养细胞节中升高的IL．113在血管内皮细胞的激活发挥重要作用。血管内皮细胞以时间依赖方式吞噬并清除滋养细胞微颗粒，但血管内皮细胞参与吞噬和清除滋养细胞微颗粒过程的受体和分子机制尚待研究。子痫前期患者胎盘来源的滋养细胞微颗粒可以激活血管内皮细胞表现为ICAM．1和IL．1D表达水平升高，滋养细胞微颗粒与子痫前期患者血管内皮细胞损伤和过度炎症反应有关。本课题还存在一些局限性，子痫前期的血清学指标异常发生在临床症状出现之前，如果采用前瞻性研究，用最终发展为子痫前期的患者早、中、晚孕期血清与早孕绒毛组织共培养，研究血清对脱落滋养细胞的性质的影响，将会为子痫前期的发病机制提供完善的依据。 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万方数据复旦大学硕士学位论文个人简历、研究成果2006．9-2011．7河南省新乡医学院临床医学学士学位2011．9一至今复旦大学附属妇产科医院科研型硕士研究生围产医学方向硕士期间发表论文情况：1．ZhaoM，ShenF，YinYX，YangYYXiangDJ，ChenQ(2012)．Heatshockprotein27expressioninepithelialovariancancer：potentialcorrelationwithpredictionofepithelialovariancancel’withperitonealmetastasisReproductiveSciences1'9：748．753(共同第一作者2．064)2．Yinyx，ShenF，PeiH，DingY，ZhaoHua，ZhaoM，ChertQ(2012)。IncreasedexpressionofRab25inbreastcancercorrelateswithlymphaticmetastasis．TumorBiology,33：1581-1587(共同第一作者2．518)3．XiaoJP，ShenF，XueQ，ChenG，ZengK，StoneP，ZhaoM，ChenQ(2013)．Isethnicityariskfactorfordevelopingpreeclampsia?AnanalysisoftheprevalenceofpreeclampsiainChina．JHumHypertens．2014Jan16．doi：10．10380hh．2013．148．(通讯作者2．818)4．XiaoJP，YinYX，GaoYF，LauS，ShenF，ZhaoM，ChenQ(2012)．TheincreasedmaternalserumlevelsofIL一6areassociatedwiththeseverityandonsetofpreeclampsia．Cytokine，60：856—860．(3．019)5．ZhaoM，DingJX，ZengK，ZhaoJ，ShenF，YinYX，ChenQ(2013)．Heatshockprotein27：Apotentialbiomarkerofperitonealmetastasisinepithelialovariancancer?TumorBiology,35：1051—1056(2．518)．6．ZhaoM，YinYX，GuoF，YangYY，ShenF，ChenQ(2012)．IncreasedRab25expressionisnotcorrelatedwithperitonealmetastasisofepithelialovariancancers．CancerInvestigation，30：683—687．(2．238)45 万方数据复旦大学硕士学位论文英文缩写缩写英文全称中文全称PEPreeclampsia子痫前期ATl．AAangiotensionIItypeIreceptor-agonistic血管紧张素II1型受体自autoantibody身抗体FGRfetalgrowthrestriction胎儿生长受限HLAhumanleukocyteantigen人类白细胞抗原VEGFVascularEndothelialGrowthFactor血管内皮细胞生长因子PlGFplacentagrowthfactor胎盘生长因子TNF．atumornecrosisfactom肿瘤坏死因子t／,lFNYinterferon干扰素1，M。CSFMacrophagecolony—stimulatingfactor巨噬细胞集落刺激因子ppET-1Preproendothelin-1前内皮素原sEngsolubleendoglin可溶性endoglinET-1endothelin1内皮素sFIt．1solublefms··liketyrosinekinase··1可溶性fms酪氨酸激酶．1TDsyncytialnuclearaggregates滋养细胞结STBMsyncytiotrophoblastmicroparticles滋养细胞微颗粒PBMCperipheralbloodderivedmacrophages外周血管巨噬细胞ICAM．1inter．cellularadhesionmolecule．1细胞间粘附分子IDOindoleamine2,3-dioxygenase吲哚胺2-3双加氧酶IL-1DInterleukin．1B白细胞介素．1BNTDNecrosistrophoblastdebris坏死滋养细胞碎片ATDApoptosistrophoblastdebris凋亡滋养细胞碎片PlARPpolyADP—ribosepolymerase多聚ADP．核糖聚合酶TRAILTumornecrosisfactorrelatedapoptosisTNF相关凋亡诱导配体inducingiigandCaspase胱天蛋白酶46 万方数据复旦大学硕士学位论文致谢在即将结束研究生的学习生活之际，我诚挚地感谢我的导师陈奇教授在课题设计及实验实施中倾注大量的心血，他严谨、求实、创新的学术作风永远是我学习的楷模。陈奇教授不仅在课题研究方面给予我的启迪指导，在生活上也给予了我无微不至的关怀，他开阔的国际视野、渊博的学识、敏锐的思维、严谨的治学态度、追求科学真理的孜孜不倦的精神，言传身教使我受益终生!他是我一生学习的榜样。在此，我谨向陈奇教授致以崇高的敬意和最衷心的感谢!衷心感谢复旦大学附属妇产科医院在我研究生学习期间给我提供出国学习的机会。衷心感谢新西兰奥克兰大学妇产科学系LarryChamley教授邀请我至奥克兰大学妇产科实验室进行课题研究，感谢PeterStone教授在课题研究中给予我的帮助和指导。感谢妇产科实验室各位同事的帮助，与您们一起做研究、讨论课题的学习生活使我终生受益。在新西兰奥克兰大学学习期间，领略了国际知名大学浓厚的积淀和创新求是的科研氛围，在科研小组课题研讨会上，大家热烈的讨论和踊跃的提议让我感受到了在科研中集思广益的重要性，学术交流会议上大师们的风采至今历历在目，实验室高效严格的管理给我留下了深刻的印象。感谢科教科何晓明老师、刘颖涛老师、张菲菲老师、陈天老师、沈晓雯老师在学习和生活中给予我的帮助。衷心感谢在新西兰学习期间，来自复旦大学附属妇产科医院的访问学者张英老师和王超老师对我学习上的指导和生活中的帮助，还记得在实验室，您们手把手教我做实验的日子，耐心向我讲解科研中的体会，使我少走了很多弯路。在生活中，给我大姐姐般的照顾，在异国他乡让我感受到了亲人般的温暖。衷心感谢临床轮转阶段，华克勤老师、易晓芳老师、汪清老师、张英老师、杨钦平老师、阴传敏老师对我的细心带教、谆谆教诲，您们用自己的行动诠释了“医技至精、医德至上”的红房子精神，谢谢您们带我行走在医学这个神圣的殿堂。感谢我的父母和亲人，永远是我最忠实的听众，最坚强的后盾，是他们的鼓励和支持使我的学业得以顺利完成。衷。t3感谢陈丽梅师姐、刘姝蓉师姐三年来给我的帮助，在学习中指点迷津，在我遇到苦难时默默的给予我支持，感谢桂玉燕师妹在我临床资料统计上默默无闻的付出!感谢我的室友和同学们，三年与你们一起愉快的生活、学习上互勉互励是很美好的一段记忆。最后，再次向所有给予我关心和帮助的老师、朋友们致以最诚挚的谢意! 万方数据复旦大学硕士学位论文综述脱落滋养细胞在子痫前期发病机制中的作用沈方陈奇【摘要】子痫前期是妊娠期特有疾病，其特征为系统性血管内皮细胞活化和过度的炎症反应。尽管，子痫前期的发病机制尚不明确，但是某些胎盘因素和母体因素参与子痫前期的发病机制的学说得到了普遍的认可。脱落滋养细胞是参与子痫前期发病的胎盘因素之一。正常妊娠过程中，从孕6周起，滋养细胞以凋亡的形式从胎盘脱落进入母体血液循环，并被阻滞在肺血管。子痫前期患者中，脱落滋养细胞的数量增加。1893年就有学者提出，脱落滋养细胞参与了子痫前期的发病过程。近期研究显示，血管内皮细胞在吞噬坏死脱落滋养细胞后发生活化，这种血管内皮细胞的异常常见于子痫前期患者。有很多可能的因素会促使滋养细胞在脱落过程中从凋亡形式变为坏死形式。其中，抗磷脂抗体，炎性细胞因子如白细胞介素6(IL．6)、转化生长因子B1(TGFBI)，子宫螺旋动脉重铸不良发挥重要作用。目前，子痫前期尚无有效的治疗方法，但是孕妇补钙和增加维生素C的摄入可以保护血管内皮细胞在吞噬坏死脱落滋养细胞后不被活化，从而降低子痫前期发病的风险。【关键词】脱落滋养细胞；子痫前期：发病机制；内皮细胞功能障碍TheRoleofTrophoblasticDebrisinthePathogenesisofPreeclampsia【Abstract】Preeclampsiaisapregnancyspecificcomplicationwhichischaracterizedbysystemicendothelialcellactivationandexaggeratedinflammatoryresponse．Althoughthepathogenesisofpreeclampsiaisunclearitiswellrecognizedthatplacentalfactor(s)andmaternalfactor(s)contributetothepathogenesisofpreeclampsia．Trophoblasticdebrisshedfromplacentaisoneofthepossibleplacentalfactors．Duringthepregnancy，trophoblasticdebrisisshedintothematernalbloodtobecometrappedagainstthematernalpulmonaryendotheliumasearlyas6weeksofgestationinanapoptosisfonll．Trophoblasticdebriswasreportedtobeinvolvedinthepathogenesisofpreeclampsiainl893．Theincreasedamountoftrophoblasticdebrisisseeriinpreeclampsia．Recentstudyshowedthatphagocytosisofnecrotictrophoblasticdebr．isresultsinendothelialcellactivationthatseeninpreeclampsia．Therearemanypotentialfactorsthatcouldswitchapoptotictrophoblasticdebrisintonecrotic．trophoblasticdebris．Ofthem，antiphospholidantibodies，inflammatorycytokineslikeIL·6，TGFl31andfailureofspiralarterytransformationplayanimportantroleorlit．Todateeventhereisnoeffectivetreatmentonpreeclampsia，48 万方数据复旦大学硕士学位论文calciumandvitaminCsupplementationmayreducetheriskfordevelopingpreeclampsiathroughpreventingendothelialcellactivationinducedbyphagocytosisofnecrotictrophoblasticdebris．[Keywords]Trophoblasticdebris；Preeclampsia；Pathogenesis；Endothelialcelldysfunction子痫前期是妊娠期特有疾病，其临床特征为妊娠前血压正常的妇女在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿。子痫前期不仅是引起母胎发病率和死亡率的主要原因，并成为曾患子痫前期妇女和出生于患子痫前期孕妇的胎儿，发生近期或远期心血管系统疾病的危险因素【1】。虽然子痫前期的发病机制尚不明确，目前的多数研究支持子痫前期是“两阶段疾病”的假说，第一阶段：早孕期各种异常因素导致滋养细胞侵袭不足、子宫螺旋动脉重铸不良，胎盘局部发生缺血、缺氧损伤。第二阶段：继发于胎盘缺血、缺氧损伤，胎盘生成释放一系列有害因子，这些有害因子介导了从胎盘滋养细胞损伤到血管内皮细胞活化、功能障碍的过程12J。在正常妊娠中，从孕6周起，胎盘母体面合体滋养细胞形成膜包裹的多核结构一一滋养细胞节(syncytialnuclearaggregates，SNA)，以凋亡形式脱落进入母体血液循环，随血流汇聚并被阻挡于肺血管床，由肺血管内皮细胞吞噬清理。但是在子痫前期患者，其脱落的滋养细胞数量明显增加，并被认为是以坏死的形式脱落。所以，坏死的脱落滋养细胞(necrotictrophoblastdebris，NTD)已经被认为是胎盘释放的有害因子之一，在子痫前期发病机制中起重要作用【3】。1正常妊娠中滋养细胞的脱落胎盘母体面的滋养细胞像其他上皮细胞一样，可发生老化和损伤，形成膜包裹的多核结构一一滋养细胞节，直径60～200um，通常有20---,50个核仁，这一过程是合体滋养细胞程序性凋亡的结果，是滋养细胞生命周期的终末阶段。脱落到母体外周血液循环的滋养细胞分为SNA及单个核滋养细胞两种，从孕6周就开始脱落，每天大约脱落100000个。脱落滋养细胞经过母体血液循环，极少一部分滞留在外周血中，大部分最后滞留在肺血管。目前还没有发现母体免疫系统参与脱落滋养细胞的清除，但是体外试验证明了肺血管内皮细胞参与脱落滋养细胞的清除，清除周期大概为3～14d，平均为3d。滋养细胞清除过程在诱导母体对胎几的免疫耐受和母体的血管耐受中也发挥重要作用14]。2子痫前期患者胎盘滋养细胞的脱落1893年，德国科学家Schmorl首次在死于子痫的孕妇肺血管中发现了多核 万方数据复旦大学硕士学位论文的脱落滋养细胞，并提出滋养细胞脱落和子痫前期发病机制有关。子痫前期患者脱落的滋养细胞碎片数量增加、胎盘可见局灶坏死、细胞滋养层细胞偶然性退化以及微绒毛丢失等改变。虽然至今没有直接证据证明子痫前期患者的脱落滋养细胞以坏死的死亡形式为主，但是近年来，有假说认为：在子痫前期患者中脱落的滋养细胞死亡途径从一种安全的“程序性凋亡途径”变为一种相对危险的“凋亡．继发性坏死”或“坏死”途径，这种假说来源于异常脱落的滋养细胞刺激母体血管内皮细胞系统发生活化、功能障碍，出现高血压、蛋白尿等子痫前期症状15J。同时过多的脱落滋养细胞如果不能被及时清除，以凋亡形式脱落的滋养细胞会产生继发坏死，从而诱发血管内皮细胞功能异常。3脱落滋养细胞在子瘸前期发病机制中的作用子痫前期患者中，来自胎盘的坏死脱落滋养细胞可激活母体血管内皮细胞系统、免疫系统，导致过度的系统性炎症反应，并在促进血液高凝状态中发挥作用，最终发展为子痫前期的一系列临床症状和体征。早孕期大鼠血液循环中注入NTD，可诱发晚孕期鼠血压高于正常对照组，进一步证明了NTD在子痫前期发病中的作用【61。3．1血管内皮细胞系统子痫前期的病理特征之一是全身性血管内皮细胞功能异常，表现为微血管痉挛，多器官血流灌注下降，这些病理改变发生于子痫前期临床表现之前。在正常妊娠过程中肺血管内皮细胞吞噬凋亡形式的脱落滋养细胞后，血管内皮细胞不发生功能障碍，并且还可以保护血管内皮细胞不受因坏死的脱落滋养细胞或炎性因子IL．6或内皮细胞激活因子LPS(脂多糖)、PMA(佛波醇酯)等的刺激而发生功能异常。这种效应依赖于血管内皮细胞吞噬凋亡的脱落滋养细胞，并且这种保护效应是短暂的，因此可以推测，在正常妊娠过程中，体内脱落的凋亡滋养细胞不断从胎盘脱落进入母体血液循环中，在保护血管内皮细胞功能中发挥重要作用17l。但是子痫前期患者胎盘表面滋养细胞倾向于以非凋亡或坏死的形式脱落。血管内皮细胞吞噬坏死形式死亡的脱落滋养细胞后，内皮细胞间黏附分子表达上升，单核细胞黏附增加，同时血管内皮细胞释放白细胞介素6(IL．6)、转化生长因子131(TGFl31)等促炎症因子，这些炎症因子可进一步引起未直接吞噬坏死脱落滋养细胞远处的血管内皮细胞发生活化、抑制血管内皮细胞的增殖。同时也诱发胎盘组织产生更多坏死的脱落滋养细胞，形成一个正反馈机制【8，9I。可溶性fms酪氨酸激酶．1(sFIt．1)是体内天然存在的血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PIGF)的拮抗剂，可与VEGF和PIGF结合，阻断后者在维持正常的血管内皮细胞功能和促进血管生成中发挥作用。sFltl水平在子痫 万方数据复旦大学硕士学位论文前期患者血清中明显升高，并且先于临床症状的出现，其升高程度与子痫前期的严重程度有关。迸一步研究发现，来自于子痫前期胎盘的脱落滋养细胞节qbsFlt一1水平升高，并且携带有代谢活性的sFlt．1mRNA，推测子痫前期患者sFlt．1水平升高与的脱落滋养细胞进入母体循环后可能发挥转录、翻译功能、新合成sFlt．1蛋白有关【10】。在缺氧条件下，脱落滋养细胞可诱发血管内皮细胞释放sFltl，造成血管内皮细胞屏障功能破坏⋯J。3．2免疫、炎症反应子痫前期时，脱落滋养细胞数量增加、生物学性质改变，被认为是诱发母体过度炎症反应的主要因素。子痫前期胎盘局部微环境改变使巨噬细胞数量增加，表面凋亡相关受体FasL活性明显增强，诱导滋养细胞凋亡增加【1引，NTD可刺激单核细胞的HLA．DIUDP(人类白细胞抗原．DR／DP受体)表达增加，增强单核细胞的抗原提呈活性。这些炎症因子可导致B淋巴细胞自身活化，活化的B细胞产生自身抗体，子痫前期患者血清中发现的血管紧张素II1型受体自身抗体(angiotensionIItypeIreceptoragonisticautoantibodyATl一AA)1131,可刺激胎盘分泌炎症因子如IL．6、肿瘤坏死因子(TNF)，和抗血管形成因子如sFltl，内皮细胞收缩因子(endothelin，ET)I等。这些因子可以诱发母体血压升高等。胎盘缺血缺氧诱导的ET．1升高可以诱发血管内皮细胞功能障碍，并与子痫前期的严重程度相关。4影响胎盘脱落滋养细胞的性质的因素4．1血流动力学异常和缺血、缺氧损伤正常妊娠时，绒毛外滋养细胞替代子宫螺旋动脉血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，使之成为高流量、低阻力、不受母体血管舒缩神经控制的血管，为胎盘提供持续、稳定的血液供应。子痫前期患者子宫螺旋动脉“重铸不良”，子宫肌层血管平滑肌的残留增加了自发性收缩的风险，血液流速增大或湍流使胎盘局部血流剪切力过大，导致与母体血流直接接触的合体滋养细胞发生形态学变化，同时伴有脱落数量的增加1141。早孕末期子宫动脉血流阻力指数高的孕妇与阻力指数正常的孕妇相比，其绒毛外滋养细胞在TNF、放线菌素D诱导凋亡的过程中，更容易发生caspase依赖性的凋亡，补充外源性一氧化氮(NO)可以显著减少其凋亡，而在子宫动脉阻力指数正常的孕妇胎盘绒毛体外培养中，抑制NO合酶的活性，可增加滋养细胞的凋亡[151。另外，绒毛间隙的血液和氧气供应处于不稳定的状态，缺氧．氧应激损伤导致滋养细胞线粒体释放细胞色素C增加、caspase3活性增加，胞浆和胞核内凋亡相关蛋白PARP(polyADP．ribosepolymerase)(多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)均升高，合体滋养细胞核溶解、凋亡增加。培养足月 万方数据复旦大学硕士学位论文胎盘绒毛组织时发现，缺氧可明显增加坏死途径的滋养细胞和p53通路相关的滋养细胞凋亡【惦】。但是，也有研究指出早孕期胎盘绒毛在低氧环境中培养，并不产生坏死形式的脱落滋养细胞，这可能是早孕期绒毛处于低氧环境中，对缺氧的刺激并不敏感，或者由于单纯缺氧刺激并不能引起氧化应激损伤【l7|。4．2炎症因子正常妊娠是一个轻度的炎症反应过程，而子痫前期患者表现为过度的炎症反应。母体血液循环中升高的促炎症细胞因子IL．6、TGFIB．1及TNFQ不但诱发脱落滋养细胞数量的增加，同时降低caspase3／7的活性改变脱落滋养细胞的生物学性质，这一改变可激活血管内皮细胞在吞噬这些脱落的滋养细胞后其表面黏附因子水平升高。促炎症细胞因子依赖于钙离子通道诱发胎盘组织滋养细胞以坏死形式脱落1|8】。促炎症因子还诱导蜕膜细胞分泌单核／巨噬细胞趋化因子，促进单核细胞迁移至胎盘，活化的单核细胞通过淋巴细胞功能相关抗原．1(LFA．1)黏附于合体滋养细胞表面，通过TNF12．依赖途径诱导其凋亡、破坏其完整性，仅仅单核细胞黏附于滋养细胞表面无此作用【l91。有趣的是，一氧化碳(CO)可减少滋养细胞的凋亡和滋养细胞脱落，这可能是吸烟人群中，子痫前期发病率相对较低的原因之一12⋯。4．3抗磷脂抗体众所周知，除了胎盘因素诱发子痫前期发病外，母体内一些因子也是诱发子痫前期发病的重要原因，其中最重要的是抗磷脂抗体。抗磷脂抗体阳性孕妇子痫前期发病风险是抗体阴性孕妇的9～10倍。早孕期绒毛组织在体外培养研究中发现，抗磷脂抗体不仅增加脱落滋养细胞数量，同时造成脱落滋养细胞的caspase3／7表达下降，提示抗磷脂抗体可以改变脱落滋养细胞的生物学特性，也就是从凋亡演变成凋亡．坏死或坏死，进而诱发血管内皮细胞在吞噬了这些脱落滋养细胞后发生功能障碍12lJ。抗磷脂抗体还可能通过凋亡相关蛋白TRAIL(TNF．relatedapoptosisinducingligand肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，TNF超家族成员)，使脱落滋养细胞数量增加或发生坏死【22|。4．4子宫收缩力分娩时，胎盘从子宫附着面剥离时，母体外周循环中有短暂的脱落滋养细胞升高，也是产后子痫发病的机制之一【23|。子痫前期患者血浆中ET．1水平明显升高，子宫平滑肌纤维体外实验证实，子痫前期患者的子宫平滑肌纤维发生ET．1诱导的钙通道依赖性的自发性收缩的幅度明显大于正常孕妇的子宫平滑肌纤维口4|。这种自发性收缩幅度的增加可能诱发早产，同时导致滋养细胞脱落数量增加，促进子痫前期病情的进展。 万方数据复旦大学硕士学位论文5预防或治疗坏死的滋养细胞诱发血管内皮细胞功能异常钙通道阻断剂(硝苯地平、维拉帕米)广泛使用于子痫前期患者血压的控制，这是因为硝苯地平、维拉帕米可以通过NO合酶通路阻断血管内皮细胞在吞噬NTD后引起的内皮细胞活化和增殖功能抑制【25]。NO合酶在血管舒张功能中发挥重要作用，在子痫前期患者中，NO水平下降，并且与系统炎症因子水平呈负相关【26l，这可能也是子痫前期患者血管内皮细胞不能抵抗吞噬坏死脱落滋养细胞后引起活化的因素之一。添加VEGF可以升高血管内皮细胞NO合酶的合成，修复sFIt。1引起的血管内皮细胞功能障碍⋯J。流行病学和临床试验表明服用抗氧化剂维生素C可以降低发生子痫前期的风险。这主要是因为维生素C可以促进血管内皮细胞对坏死脱落滋养细胞的清除，并保护吞噬坏死脱落滋养细胞的血管内皮细胞不发生活化，同时抑制促炎症细胞因子IL．6的分泌127|。另外临床试验还表明孕妇补钙可以降低子痫前期的发病率，尤其是在钙摄入水平较低的人群和子痫前期高危人群中，因为低钙可引起血管内皮细胞活化。血清钙水平较低时，可刺激甲状旁腺激素或肾素释放，导致血管平滑肌细胞内钙水平升高，血管收缩【28J，补钙后可以降低血管平滑肌细胞内钙水平的反应性升高。虽然补钙不能改变由IL，6刺激后产生的坏死脱落滋养细胞，但是可以通过NO合酶通路保护血管内皮细胞不受NTD的刺激而发生活化，提示补钙可以保护子痫前期患者血管内皮细胞功能晗引。6总结．综上所述，滋养细胞脱落是一个正常的生理过程，但是不管什么原因，只要造成脱落的滋养细胞从凋亡演变成坏死时，就会诱发具有吞噬功能的肺血管内皮细胞功能异常，导致孕妇血压上升。虽然目前还没有发现抑制滋养细胞异常脱落的治疗方法，但是孕妇补钙和增加维生素C可以抑制血管内皮细胞因吞噬坏死的脱落滋养细胞而引起的血管功能异常。有必要进一步研究影响滋养细胞脱落及其转归的因素，为药物干预或阻断滋养细胞异常脱落提供理论依据，为子痫前期的治疗提供可能。参考文献[1】DavisEF，NewtonL，LewandowskiAJ，eta1．Pre—eclampsiaandoffspringcardiovascularhealth：mechanisticinsightsfromexperimentalstudies[J]．ClinSci(Lond)，2012，123(2)：53—72．[2]RobertsJM，HubelCA．Thetwostagemodelofpreeclampsia：variationsonthetheme[J]．Placenta，2009，32-37．【3]CrockerI．GaborThanAwardLecture2006：pre—eclampsiaandvilloustrophoblast 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