小细胞肺癌细胞系h446中癌干细胞及其转移亚群的研究

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1、天津医科大学硕士学位论文中文摘要研究目的：1、阐明小细胞肺癌细胞系H446中uPAR+细胞的干细胞特性。2、证明u_PAR+细胞群进一步可分为uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4一亚群，其中uPAR+CXCR4+亚群细胞是转移性肿瘤干细胞。研究方法：1、首先用流式细胞分选术从小细胞肺癌细胞系H446中分选出uPAR+和uPAR一细胞，然后通过①裸鼠体内成瘤实验，②体外无血清成球实验，③细胞分化实验，@Transwell体外侵袭实验，比较上述两组细胞的致瘤能力、自我更新能力、分化潜能和侵袭能力，从而证明uPAR+细胞具有干细

2、胞特性。2、进一步用流式细胞术检测uPAR+细胞亚群中CXCR4的表达，通过uPAR．FITC和CXCR4．PE双荧光抗体标记的方法证实存在uPAR+CXCR4+细胞亚群，并分选出uPAR+CXCR4+和uPAR十CXCR4一细胞。通过@Transwell迁移实验，比较上述两组细胞体外迁移能力，②裸鼠皮下接种上述两组细胞，构建小鼠体内转移瘤模型，比较这两组细胞的体内迁移能力，从而证明uPAR+CXCR4+亚群细胞是转移性肿瘤干细胞。3、通过免疫组织化学法，观测人小细胞肺癌组织中uPAR和CXCR4的表达和分布，并分析其与临床参数的

3、关系。结果：1、uPAR+细胞具有干细胞特性(1)uPAR+细胞具有高致瘤能力。流式细胞术分选出uPAR+和uPAR一细胞，在裸鼠皮下分别接种103个不同亚群细胞。一周后，接种uPAR+细胞组小鼠皮下形成直径约3mm的移植瘤，而接种uPAR一细胞的小鼠未见瘤形成。将uPAR+细胞形成的原代移植瘤分割成2mm3小块继续接种于裸鼠皮下，形成第二代移植瘤，以此进行连续传代。在连续传代过程中，uPAR+细胞保持了致瘤的稳定性，至今已在体外连续传代12次，且uPAR+细胞在移植瘤中的表达率基本保持不变。三代以后瘤形成时间缩短，肿瘤生长速度明

4、显加快。(2)uPAR+细胞具有自我更新能力。将分选的uPAR+和uPAR一细胞分别按1×103／mL密度用无血清培养基接种于六孔板内。培养三天后观察到uPAR+细胞有所含细胞数约为10个左右的肿瘤细胞球形成，呈悬浮生长；7天后每个球体天津医科大学硕士学位论文所含细胞数有几十个甚至上百个。而uPAR一细胞三天时未见肿瘤细胞球形成，7天时细胞均已死亡。(3)uPAR+细胞具有分化能力。将分选的uPAR+和uPAR一细胞置于含有10％血清的分化培养基中，生长三天后对分化细胞进行免疫荧光检测，结果显示：分选的uPAR+细胞高表达uPAR

5、，不表达Cytokeratin和CD56，培养三天后失表达uPAR，高表达Cytokeratin和CD56；uPAR一细胞标志物未见明显改变，始终不表达uPAR，高表达Cytokeratin和CD56。进一步，将两组细胞分别放入含有VEGF因子存在的三维培养基中，经一周培养，uPAR+细胞分化形成管腔样结构，免疫荧光染色uPAR表达下降，可见血管内皮细胞标志物CD31的表达；接种uPAR+细胞的裸鼠移植瘤组织中可见少量肿瘤细胞有血管内皮细胞标志物Ⅷ相关抗原表达。而uPAR一细胞在上述实验中既无管腔样结构形成也不表达血管内皮标志物。

6、(4)uPAR+细胞具有高侵袭性。通过Transwell侵袭实验比较发现，uPAR+细胞穿过基底膜的数量大于uPAR一细胞(P<0．05)，提示uPAR+细胞侵袭能力大于uPAR一细胞。进一步，免疫荧光染色显示：uPAR+细胞不表达上皮细胞标志物E．cadherin，高表达间质细胞标志物Fibronectin和Vimentin。表明其侵袭机制可能和细胞发生EMT有关。2、转移性肿瘤干细胞uPAR+CXCR4+亚群的分离鉴定流式细胞术检测CXCR4在uPAR+细胞中的表达：用uPAR．FITC和CXCR4．PE双荧光抗体标记H446

7、细胞，流式分析结果显示：H446细胞中存在uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4一细胞亚群，其含量分别为1．3％和7．1％，证实uPAR+细胞可进一步分为uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4一细胞亚群。(1)Transwell迁移实验结果：通过Transwell迁移实验比较uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4一细胞的迁移能力，结果显示：在SDF．1趋化下，uPAR+CXCR4+组细胞穿过基底膜数明显多于uPAR+CXCR4一组细胞(P<0．05)。两组细胞加入AMD3100预处理后，在SDF．1趋化下穿过基底

8、膜细胞数无明显差异(P>0．05)。提示uPAR+CXCR4+细胞亚群具有很高的迁移能力，其迁移能力与CXCR4的作用密切相关。(2)体内转移实验结果：裸鼠皮下分别接种103个uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4一细胞，一周后均有移植瘤形成