鼠痘病毒环介导等温扩增检测法的建立

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1、鼠痘病毒环介导等温扩增检测法的建立DevelopmentofLoop-·mediatedisothermalamplificationmethodforthedetectionofEctromeliavires研究生：赵丽娟导师：薛整风研究员高诚研究员扬州大学兽医学院比较医学中心二。一四年六月赵丽娟：鼠痘病毒环介导等温扩增检测方法的研究鼠痘病毒环介导等温扩增检测法的建立研究生：赵丽娟导师：薛整风高诚研究员中文摘要环介导等温扩增法(LAMP)是一种新的核酸扩增法，在2000年初次出现。主要原理是对靶

2、基因上人为设定的六个独立保守区，根据这六个区设计四种特异性引物：包括一对内引物(FIP和BIP)和一对外引物(F3和B3)。结合链置换DNA聚合酶在恒温条件(63℃左右)下保持30～60分钟。该方法在一定的温度下经过一步即可完成扩增，扩增效率极高，可在30～60分钟内实现109～1010倍的扩增。LAMP方法在实验结果观测上也具有显著优势。LAMP扩增反应结束会产生白色沉淀，而在反应中加入钙黄绿素就能在反应结束看到颜色变化，有黄绿色荧光即代表反应发生了扩增，无需经过电泳鉴定。由于其扩增效率高、反应

3、简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点，LAMP法现今已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断。本实验基于LAMP方法的原理对鼠痘病毒和仙台病毒进行检测并与传统PCR方对比，建立鼠痘病毒和仙台病毒的LAMP检测方法。根据鼠痘病毒保守基因设计多对LAMP引物，在实时浊度仪的跟踪监测下筛选出最佳引物进行实验。设定反应条件为63℃、反应时间为1小时，然后进行特异性实验和敏感性实验。结合PCR方法，对比两种实验方法的敏感性优劣。结果显示引物筛选实验选出一对基于Crmd基因设计的引物。

4、而在特异性实验中证明其具有良好的特异性，应用这对引物与小鼠其他病毒反应，在设定时间内均不发生扩增。而鼠痘病毒反应迅速，在30分钟左右即开始发生扩增，并在5分钟之内达到了扩增高峰。在敏感性实验中，把鼠痘病毒DNA十倍稀释成100至10。6的7个稀释度，最后结果显示其最小检出度为5．3x104ng／gL。敏感度比PCR高。为了简化实验结果观测方法，在鼠痘LAMP检测反应中加入钙黄绿素荧光指示剂，对比阴性对照，结果显示发生扩增的反应出现了黄绿色荧光，肉眼明显可见。进一步经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后出现连续性

5、的条带。在标准法LAMP实验的基础上，为了达到进一步加快反应速率的效果，在原始LAMP扬州大学硕士学位论文引物的基础上设计了环引物。LAMP环引物是指在哑铃状结构5’末端环状单链区段(B1到B2区段、Fl到F2区段)加入具有与之互补序列的环状引物LoopPrimerF(LF)、LoopPrimerB(LB)，LF和LB使DNA合成起点变多，因此扩增反应进一步加速。本实验中鼠痘病毒环引物只设计了一条LB，但在实验中依然使反应速率有一定的提高。而在动物的回归实验中，选用BALB／c小鼠和BALB／c裸

6、鼠，病毒液浓度做10倍稀释后分为6组进行腹腔注射。采取小鼠血清和各器官组织，用血清做间接ELISA检测，提取DNA作为LAMP实验的样本进行实验。结果显示LAMP所有样本均能发生扩增，间接ELISA检测抗体实验BALB／c小鼠组阳性，而裸鼠组阴性。面对间接ELISA检测抗体可能出现的假阳性现象，LAMP有着更方便直观的优势。关键词：鼠痘病毒：环介导等温扩增：检测赵丽娟：鼠痘病毒环介导等温扩增检测方法的研究DevelopmentofLoop-mediatedisothermalamplificati

7、onmethodforthedetectionofEc仃omeliavirusM．S．Candidate：lijuanZhaoSupervisor：Prof．ZhengfengXueProf．ChengGaoAbstractLoop—mediatedisothermalamplification(LAMP)isanovelnucleicacidamplificationapproachthatwasfirstlyreportedin2000．ThemechanismofLAMPisdesignin

8、gfourspecificprimersaccordingtosixseparateconservativeregionsofthetargetgenes，includingacoupleofinternalprimers(FIPandBIP)andacoupleofexternalprimers(F3andB3)，andcombiningtheBstDNApolymeraseataconstanttemperature(63。C)for30·60min．Atagiventempe