载基因超声微泡造影剂治疗肝纤维化的实验研究

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1、重庆医科大学博士学位论文载基因超声微泡造影剂治疗肝纤维化的实验研究姓名：汪朝霞申请学位级别：博士专业：生物医学工程（超声医学）指导教师：王志刚20090501重庆医科大学博士研究生学位论文载基因超声微造影剂治疗肝纤维化的实验研究摘要肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，其本质是以胶原为主的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)合成增多，而降解相对减少，两者失去动态平衡，致使过多的ECM沉积于肝内，同时伴有肝实质的广泛破坏和再生，导致肝小叶和肝血管结构的紊乱，最终可引起肝功能失代偿、腹水、上消化道出血等一系列并发症。肝纤维化在进入肝硬化前尚可逆转，因此人们

2、十分重视肝纤维化的研究，特别是基础研究已取得较大的进展，已可从基因水平上认识肝纤维化的治疗。目前，常用的一般方法是将足够的治疗性基因导入受损的肝脏，使外源性基因得到表达调控，达到延缓和治愈肝纤维化的目的。针对肝纤维化的形成机制，其基因治疗途径主要包括抑制HSC的活化、促进ECM降解、抑制间质炎症反应和促进肝细胞增生。目前，主要是在肝脏受到慢性损伤刺激或发生纤维化后，针对肝纤维化发生的某些环节，即针对特定的细胞因子，在体细胞基因水平进行调控，以达到阻止肝纤维化病理进展的目的。肝纤维化基因治疗针对的重要因子包括：转化生长因子一13(transforminggrowthfact

3、or—p，TGF—B)、结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)、表皮生长因子(epidermalgrowth本课题由国家自然科学基金重点项目(30430230)，国家高技术研究发展计划(863计划)(2006AA0224F0)，及重庆市自然科学基金重点项目(CSCT,2005BA5024)资助3重庆医科大学博士研究生学位论文factor，EGF)、角质细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)、肝再生增强因子(augment

4、erofliverregeneration，ALR)、白细胞介素(interleukin，IL)和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)、基质金属蛋白酶抑制剂(inhibitorsofMMP，TIMP)等。肝细胞生长因子(HGF)可以作为肝纤维化基因治疗的一种手段。HGF主要由间质细胞衍生的多功能因子，通过自分泌或旁分泌的方式作用于上皮源性的细胞，诱导细胞有丝分裂、促进细胞移动并且对抗细胞因子诱导的凋亡。HGF能调节胶原纤维的合成和炎性反应，在治疗创伤愈合、防止组织纤维化中起着重要的作用。因此，它在肝纤维化发病机制中的地位也越来越受到重

5、视。尽管国内外学者已经做了许多努力，外源基因导入人体组织细胞的安全性和有效性尚难以令人满意，这也成为基因治疗应用于临床的主要障碍。目前主要有两类基因载体系统：病毒载体和非病毒载体，病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等，非病毒载体包括质粒DNA、脂质体等。这两类载体有其各自的优缺点；病毒载体在基因转染效率方面有很大优势，但载体本身的安全性限制了其广泛应用；非病毒载体毒性小、无免疫原性，制剂可高度浓缩，但其基因转染效率远远低于病毒载体，且缺乏靶向性。为了寻找一种更安全、高效的基因转染方法，我们将超声微泡造影剂作为载体。超声微泡造影剂(以下简称微泡)是由类似红细胞大小的

6、含气微泡组成，注入静脉后能到达红细胞所能到达的部位，使血流丰富的实质器官如心肌、肝脏、肾脏等在二维超声仪检测时产生较4重庆医科大学博士研究生学位论文强对比显影。新近研究发现，超声靶向破坏微泡(ultrasoundtargetedmicrobubbledestruction,UTMD)是增强基因转染的方式之一。微泡不但可以作为基因转染的远程靶向促进剂，在基因传输过程中保护基因；而且超声靶向破坏微泡(UTMD)产生的机械效应和空化效应可使细胞膜通透性增加，并致直径s7“m的微血管破裂，内皮细胞间隙增宽，靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内，同时微泡破裂产生的冲

7、击波、射流作为一种驱动力量，可促使从微泡上释放出来的基因进入靶细胞达到靶向提高基因转染效率目的。因此，超声靶向破坏微泡(UTMD)具有安全无创、低免疫原性、可反复应用以及器官特异性和超声可到达靶器官的广泛适用性等诸多优势。基于以上理论，本课题通过制备载HGF基因的超声微泡造影剂，然后运用超声靶向破坏微泡(UTMD)介导HGF基因治疗大鼠肝纤维化，观察治疗后HGF基因在组织细胞内的表达情况及治疗效果，为肝纤维!化基因治疗提供一个新的途径和手段，为研究和评价超声靶向破坏微泡(UTMD)介导的肝脏基因转染提供可靠的实验依据。本课题研