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58生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第10期猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2基因的遗传变异分析1111111,2,31贾怀杰,陈国华,房永祥,王晓霞,李小庆,莫斯科,瞿惠玲,景志忠(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室,兰州730046;2.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;3.甘肃省兽医局,兰州730030)摘要:采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RTPCR检测可扩增出PRRSVORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSVORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR2332相比缺失第482位和533561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;JX0708株;分离鉴定;Nsp2基因;遗传变异分析中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:16717236(2010)10005805猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveand株引起的以高热、呼吸困难为主要症状,高发病率和respiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综高死亡率为显著特征的急性传染病,随后波及全国合征病毒(porcinereproductiveandrespiratory大部分区域,导致生猪大批死亡,造成巨大的经济损syndromevirus,PRRSV)引起的接触性传染病,主失(李真光等,2009)。要引起母猪怀孕后期流产、早产、死胎、弱胎和木乃PRRSV属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉伊胎等的繁殖障碍,哺乳仔猪出现呼吸道症状和断炎病毒属,为单股正链RNA病毒(Cavanagh,奶前死亡率增高(殷震等,1997)。PRRS于1987年1997)。PRRSV不同分离株核苷酸序列存在广泛首先暴发于美国(Conzelmann等,1993)。1990年,而明显的变异,依据血清学试验及结构基因序列分荷兰科学家Wensvoort博士首次从感染猪体内分析,可将PRRSV划分为2种基因型或亚群:以LV离到该病毒,并命名为Lelystad病毒(LV)(Terp株为代表的欧洲型(A亚群)和以VR2332为代表stra等,1991);1992年美国研究人员用CL2621细的美洲型(B亚群),欧洲型主要流行于欧洲地区,而胞也分离到PRRSV,并命名为VR2332毒株(Col美洲型则主要流行于美洲和亚洲,但丹麦等一些欧lins等,1992)。目前亚洲的日本、韩国、菲律宾等国洲国家出现了两型PRRSV的感染。目前,中国所也有该病报道。1995年国内某些猪场发生疑似报道的分离株均为美洲型PRRSV,尚未见欧洲型PRRS病例,1996年国内该病料中分离到PRRSV,毒株。本研究对2007年8月采自江西省某猪场疑从而证实了本病在中国的存在(郭宝清等,1996)。似猪繁殖与呼吸综合征的病料进行PRRSV病原检目前已出现多种变异株(魏宏等,2007;张彩勤等,测、病毒分离、鉴定和Nsp2非结构蛋白基因进行遗2008;高志强等,2004)。2006年以来,在中国江西、传变异分析。江苏、湖南、安徽等南方省份暴发了由PRRSV变异1材料与方法1.1材料收稿日期:201003051.1.1病料来源组织病料采自江西某猪场疑似作者简介:贾怀杰(1980-),男,甘肃人,硕士,研究实习员,主要从猪繁殖与呼吸综合征病死猪的脾脏、肺脏、淋巴结、事人兽共患病及病原与宿主分子生物学和免疫学研究。血液等。通信作者:景志忠(1964-),男,研究员,硕士生导师,主要从事1.1.2试验动物试验猪为家畜疫病病原生物学人兽共患病及病原与宿主分子生物学和免疫学研究。国家重点实验室封闭饲养、繁殖的合作猪。Email:zhizhongj@yahoo.com.cn基金项目:国家自然基金项目(30871884);国家支撑计划1.1.3细胞株、菌株、载体和培养基Marc145细(2006BAD31B03);甘肃省支撑计划(0804NKCA076)。胞购自中国兽医药品监察所,DH5菌种系家畜疫 中国畜牧兽医2010年第37卷第10期生物技术59病病原生物学国家重点实验室保存,pGEMTeasy检测。载体购自Promega公司,DMEM培养基购自Gibco1.2.3TCID50的测定将第8代细胞毒用维持液18公司,胎牛血清购自HyClone有限公司。作10至10连续系列稀释,加入到96孔板中生长1.1.4化学试剂和工具酶Trizol提取试剂盒购良好的Marc145单层细胞上,每个稀释度重复8TM自Invitrogen公司,Impro反转录试剂盒购自孔,每孔0.1mL,其余为对照孔。每个接毒孔再加Promega公司,PCR试剂盒(包括TaqDNA聚合入0.1mLDMEM维持液,对照孔加入0.2mL。酶、dNTPMixture、10TaqBuffer)、限制性内切于37&50mL/LCO2培养箱中孵育7d,逐日观察酶EcoR!、DL2000DNAMarker均购自大连CPE,记录结果。TaKaRa公司;氨苄青霉素(Amp)购自Amresco公1.2.4动物回归试验取第8代细胞毒,按3、5和司;DNA胶回收和质粒提取试剂盒购自博大泰恒公7mL3个剂量组,每组2头,采用鼻腔内接种和颈司;其余试剂均为进口或国产分析纯。部肌肉注射的方式接种试验猪;另设1个对照组,隔1.2方法离饲养;每天观察仔猪的精神状态及测量体温;分别1.2.1组织病料的RTPCR检测∀引物设计。于第10和21天剖杀试验猪,采集组织样品检测根据美洲型参考毒株VR2332的ORF7基因,用ORF7基因。Oligo6.0生物软件设计特异性引物,引物序列为1.2.5病毒粒子形态电镜观察收集细胞毒,经浓P1:5#GCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGG3#,P2:缩、纯化后于透射电镜下观察病毒粒子的形态。5#GCGTCGGCAAACTAAACTCCACAG3#,预计扩1.2.6Nsp2非结构蛋白基因克隆及遗传变异分析增片段为309bp。∃组织病料中PRRSVORF7基∀引物设计。根据美洲型参考毒株VR2332的因检测。取适量肺组织块处理后,按照Invitrogen公司Trizol提取试剂盒的说明书提取病毒总RNA,Nsp2非结构蛋白基因,用Oligo6.0生物软件设计TM2对特异性引物,分段扩增其全长基因,引物序列为并将提取的病毒RNA按照Impro%反转录试剂盒的说明书反转录为cDNA。以合成的cDNA为模P3:5#GTTTGGCAGTCATAAGTGGTACGG3#,板,利用P1和P2为扩增引物,检测PRRSVORF7P4:5#CTGGTGCGTCAGCGTTGTTGTC3#;P5:基因,在PCR反应管中加入下列溶液及试剂:cD5#TAACGGTTCGGAAGAAACTGTC3#,P6:5#NA模板3L,10PCRBuffer5L,2.5mmol/LCTGTCAAGGGCAAGGTGAG3#。∃Nsp2非结dNTPs4L,25mol/L上、下游引物各1L,Taq构蛋白基因克隆及其序列分析。从PRRSVORF7DNA聚合酶0.5L,用无RNA酶水补足50L。基因RTPCR检测为阳性的细胞培养物中提取病PCR反应条件:95&预变性5min;94&变性30s,毒总RNA,并反转录为cDNA,以此为模板,分别以57&退火30s,72&延伸50s,30个循环;72&延P3和P4、P5和P6为PCR扩增引物,分A、B两端伸30min。扩增完成之后,取PCR产物5L用扩增Nsp2非结构蛋白全长基因。建立50LPCR1.5%琼脂糖凝胶(含0.5g/mLEB)电泳,观察结反应体系:cDNA模板3L,10PCRBuffer5L,果。∋序列测定与分析。将PCR产物按DNA胶2.5mmol/LdNTPs4L,25mol/L上、下游引物回收试剂盒回收以后,克隆到pGEMTeasy载体,各1L,TaqDNA聚合酶0.5L,用无RNA酶水经PCR、EcoR!酶切鉴定阳性的质粒送上海生工补足50L。PCR反应程序:94&预变性5min;4生物工程有限公司测序,测序结果与GenBank公布&变性1min,59&(B片段为58&)退火1min,72的序列进行比较分析。&延伸2min(B片段为2.5min),共35个循环;最1.2.2PRRSV流行株的分离将RTPCR检测后72&延伸30min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检为阳性病料做相应处理后,接种于生长良好的查。∋序列测定及分析。将PCR产物按DNA胶Marc145细胞,37&感作1h,然后补足维持液(20mL/L胎牛血清的DMEM培养液)于37&50回收试剂盒回收以后,克隆到pGEMTeasy载体,mL/LCO2培养箱中培养,每代培养观察5~7d,如经PCR、EcoR!酶切鉴定阳性的质粒送往上海生没有病变则收集培养物进行盲传。当细胞病变达到工生物工程有限公司测序,测序结果与GenBank公70%左右的时候收集病毒并于-70&保存,并取每布的序列进行比较分析。代细胞培养物进行PRRSVORF7基因RTPCR2结果与分析 60生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第10期2.1组织病料中PRRSVORF7基因的RTPCR盲传至第3代时发现接毒的细胞比未接毒的对照细检测利用合成的PRRSVORF7基因特异性引物胞胰酶消化的时间明显缩短,传至第6代时出现明扩增到了约300bp的目的片段,与预期目的基因片显的细胞病变,主要表现为细胞聚集、成堆、脱落,最段大小一致(图1),说明采集的病死猪肺脏组织中后形成空洞(图4)。取每代细胞培养液提取病毒总可能存在PRRSV。RNA,进行RTPCR检测,结果从盲传第3代以后的细胞培养液均能扩增出PRRSVORF7特异性片段,表明通过Marc145细胞传代,从病料中成功地分离到PRRSV流行毒株JX0708株。图1ORF7基因的PCR结果注:M,DNA标准DL2000;1,临床样品;2,阴性对照。2.2ORF7基因克隆及序列分析PCR产物经纯化、回收后克隆到pGEMTeasy载体,经PCR、EcoR!酶切鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与GenBank登录的国内外PRRSV分离株序列进行同源性比较。结果表明,本试验所克隆的组织病料中PRRSVORF7基因片段与美洲型参考毒株VR2332序列一致性达93.9%,与欧洲型参考毒株LV序列一致性仅为69.8%,与国内其它地区美洲型分离株序列一致性达99%以上。该结果显示,采集的疑似PRRS病死2.4TCID50的测定将第8代分离毒接种于猪的肺脏中存在PRRSV,且为美洲型毒株,将该毒Marc145单层细胞的96孔细胞培养板中,连续观株命名为JX0708株。察7d,计算CPE孔数。按照卡式法计算JX0708株利用DNAStar软件绘制不同分离株PRRSV8.02TCID50=10/mL。ORF7基因系统进化树(图2),结果显示,组织病料2.5回归试验仔猪出现高热稽留(图5),厌食或中PRRSV与美洲型参考毒株VR2332(PRU87392)不食,眼结膜炎,咳嗽、气喘,全身发红等临床症状。为同型,但该分离毒株发生了一定的变异。剖杀动物,剖检时口腔内未见出血、溃疡等病变;胸腔内心肺表面都有淡黄色纤维样渗出,肺部有较大面积的暗紫色肉样变,表面有大量出血点;肝脏肿大,质地较脆,表面有大量出血点;脾脏边缘梗死;肾脏肿大,表面有大量针尖状出血点;肠系膜淋巴结出血肿大;腹腔有大量积液;采集其脑、肺脏、淋巴结、肝脏、肾脏、脾脏及全血处理后,提取病毒总RNA,检测PRRSVORF7基因,结果从脑、肺脏、淋巴结、图2PRRSVORF7基因的系统遗传进化树肝脏、肾脏、脾脏中检测到了PRRSVORF7基因。2.6病毒粒子的电镜观察细胞培养物经浓缩、脱2.3病毒的分离将经过处理的病料接种于脂、纯化后磷酸钨负染电镜观察,可见核衣壳直径约Marc145细胞(图3),培养72h,细胞未出现病变; 中国畜牧兽医2010年第37卷第10期生物技术61图5猪体温变化趋势图为20nm的病毒粒子(图6)。图8Nsp2B非结构蛋白基因的PCR扩增注:M,DNA标准DL2000;1,PCR产物。分离株氨基酸序列进行同源性比较,结果显示,本试验所克隆的JX0708株Nsp2蛋白与国内近年来所分离的其他高致病性PRRSV毒株(北京株(EU097709)、河南株(EU200962)、湖北株(EF075945)、湖南株(EF517962)、江西株(EU708726)、辽宁株(EU109502)、宁夏株(EU097706)和武汉株(EU187484))有较高的同图6病毒粒子电镜形态(60000)源性,而且与美洲型代表株VR2332(PRU879392)和美国株(AY545985)相比,JX0708株在第482氨2.7Nsp2非结构蛋白全长基因的克隆以细胞培基酸位点缺失1个色氨酸(W);在第533561位点养物提取病毒总RNA为模板,以P3和P4,P5和P6为引物分别进行A和B片段的RTPCR扩增,连续性缺失了29个氨基酸(图9)。由此可知所分离PRRSVJX0708美洲型分离株与文献报道的相结果扩增出了大小约1600、2300bp的2个片段,与一致,为高致病性PRRSV变异毒株。预期结果相符(图7、8)。3讨论与小结2006年5月以来,最初称为(高热综合症)的猪病在中国南方部分省区首先暴发,随后,该病在中国广泛传播,给中国养猪业造成巨大的经济损失(韦天超,2009)。为了进一步探讨此次高热症疫情是否为PRRSV所致,从甘肃、陕西、湖南、江西等6省的15个猪场采集了临床表现(高热症)猪的脾脏、肺脏、淋巴结、血液等样品共45份病料。然后选择RTPCR检测为PRRSV阳性且临床症状较典型病料,通过Marc145细胞传代分离病原,结果从江西某猪场采图7NspA非结构蛋白基因的PCR扩增集的样品中成功分离出了1株PRRSV,命名为注:M,DNA标准DL2000;1,PCR产物。JX0708株;通过对JX0708分离株ORF7基因序列2.8Nsp2非结构蛋白全长基因的遗传变异分析及分子遗传演化分析,证实该病毒为PRRSV美洲PCR产物经纯化、回收后克隆到pGEMTeasy载型毒株。体,经PCR、EcoR!酶切鉴定阳性的质粒送往上海以前分离PRRSV时发现病毒对细胞的适应性生工生物工程有限公司测序。将Nsp2序列测定结往往不强,病毒分离经验是先将病毒在原代猪肺泡果用DNAStar软件进行拼接,拼接后可知所克隆的巨噬细胞(PAMs)上进行病毒适应,然后转入传代基因片段大小为3739bp,片段内包含的Nsp2基因细胞系(如Marc145、CL2621等)上进一步适应,但大小为3496bp。将克隆的Nsp2基因编码的氨基是细胞病变也不是十分明显。本研究对PRR酸序列与GenBank登录的国内外美洲型PRRSVSVORF7检测为阳性的样品,处理后直接接种于 62生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第10期图9Nsp2氨基酸同源性分析Marc145细胞,将接毒的细胞进行盲传,至第3代及其部分生物学特性研究[D].北京:中国农业科学院,2009.2张彩勤,王旭荣,杨增岐,等.猪繁殖与呼吸综合征河南毒株时比未接毒的对照细胞胰酶消化的时间明显缩短,Henan1的分离及其Nsp2、ORF3、ORF5的序列分析[J].西北农至第6代时出现明显的细胞病变,主要表现为细胞业学报,2008,17(1):1~6.聚集、成堆、脱落,最后形成空洞。将第8代分离毒3李真光,冷雪,齐巧玲,等.猪生殖与呼吸综合征病毒NM1株的接种于Marc145单层细胞,连续观察7d后,计算分离鉴定及其Nsp2基因的序列分析[J].中国兽医科学,2009,8.0239(04):293~297.出JX0708株的感染滴度为10/mLTCID50。分4殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,1997.离的毒株在细胞传代过程中,每一代均能检测到5郭宝清,陈章水.哈兽研所首次证实国内猪群存在PRRSV感染PRRSV基因,证实该PRRSV毒株能够在Marc[J].畜牧兽医科技信息,1996(1):8.145细胞中稳定增殖,其对Marc145细胞具有很强6高志强,郭鑫,查振林,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析[J].农业生物技术学报,2004,12(3):283~287.的适应性和敏感性。7魏宏,林锋强,周伦江,等.猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒福州株Nsp2基因是PRRSV全基因组中变异最大的ORF27基因结构分析[J].中国畜牧兽医,2007,34(1):82~85.区域之一,对这个基因变异的分析在一定程度上可8CavanaghD.Nidovirales:anewordercomprisingcoronaviridae以反映PRRSV整个基因组的变异趋势。因此本研andarteriviridae[J].ArchVirol,1997,142:629~633.究选择了该基因作为研究PRRSV变异趋势的主要9CollinsJE,BenfieldDA,ChristiansonWT,etal.Isolationofswineinfertilityandrespiratorysyndromevirus(isolateATCC对象。有文献报道,流行于中国的猪(高热症)主要VR2332)inNorthAmericaandexperimentalreproductionof是变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒所致,thediseaseingnotobioticpigs[J].JVetDiagnInvest,1992,4:该病毒的特征是Nsp2蛋白缺失第481位(L)和117~126.533561位29个氨基酸。本研究所分离到的10ConzelmannKK,VisserN,VanWoenselP,etal.MolecularcharacterizationofporcinereproductiveandrespiratorysynPRRSVJX0708株,符合高致病性PRRSV毒株dromevirus,amemberofthearterivirusgroup[J].Virology,Nsp2蛋白共缺失30个氨基酸的特征(Zhou等,1993,193(1):329~339.2008)。Nsp2缺失30个氨基酸导致该毒株的毒力增11TerpstraC,WensvoortG,PolJMA.Experimentalreproduction强,引起高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫情,给中国养ofporcineepidemicabortionandrespiratorysyndrome(mysteryswinedisease)byinfectionwithLelystadvirus:Koch∗spostu猪业带来极大的打击。因此,该研究进一步证实了中latesfulfilled[J].VetQ,1991,13:131~136.国本次猪(高热症)疫情确实为PRRSV变异毒株所致。12ZhouYJ,HaoXF,TianZJ,etal.HighlyvirulentporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemergedinChina参考文献[J].TransboundaryandEmergingDiseases,2008,55:152~1韦天超.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒人工感染模型的建立164.IsolationandIdentificationofPRRSVJX0708Strain,andAnalysisonGeneticVariationofNsp2Gene 中国畜牧兽医2010年第37卷第10期生物技术63猪蛔虫感染相关基因07E12的RNAi研究1,21,21,21,21,2黄翠琴,陈宏惠,黄其春,陈星星,郑新添(1.龙岩学院生命科学学院,龙岩364000;2.预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室(龙岩学院),龙岩364000)摘要:为寻找猪蛔虫免疫防治的(关键)靶分子,从已构建的猪蛔虫感染期幼虫消减cDNA文库中筛选了一感染相关基因(EST编号为07E12),采用RNA干扰(RNAi)技术对该基因的功能进行了初步探讨。针对其EST序列设计了1对特异引物,体外转录合成双链RNA(dsRNA)后,通过浸泡的方式将dsRNA导入猪蛔虫感染期幼虫中,在浸泡后的4个不同时间点采用RTPCR方法检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明,在浸泡后24、48、72h都检测到了相对应基因表达的存在,但表达量随时间依次减少,96h之后试验组没有检测到07E12的相应RNA的表达,提示dsRNA进入虫体并逐渐发挥了干扰作用,说明该基因在猪蛔虫幼虫感染宿主的过程中可能扮演重要角色。关键词:猪蛔虫;感染相关基因;RNA干扰;功能中图分类号:A852.7文献标识码:A文章编号:16717236(2010)10006305RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双次将dsRNA注入秀丽新杆线虫(Caenorhabditis链RNA引起基因沉默的过程,是生物界中普遍存elegans)中,引发了抑制特异基因的表达后,RNA在、特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御干扰这一技术已广泛应用于寄生虫基因功能的研(免疫)应答现象(Plasterk,1998)。Fire等(1998)首究。由于寄生线虫基因和秀丽新杆线虫存在较高的相似性(LizotteWaneiwski等,2000),有不少研究收稿日期:20100517者借助秀丽新杆线虫来研究这些基因的功能(Issa作者简介:黄翠琴(1978-),女,福建人,博士,从事寄生虫功能等,2005;邹丰才等,2006),然而在阐明寄生虫与宿基因组学研究。主之间的共生关系的机制方面,单纯借助营自由生基金项目:福建省自然科学基金项目(2008J0070);福建省科技计划项目(2008N2005)。活的秀丽新杆线虫来研究寄生线虫感染相关基因的111111JIAHuaijie,CHENGuohua,FANGYongxiang,WANGXiaoxia,LIXiaoqing,MOSike,1,2,31QUHuiling,JINGZhizhong(1.KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealthofMinistryofAgriculture,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;3.VeterinaryBureauofGansuProvince,Lanzhou730030,China)Abstract:Suspectedspecimenscollectedfrompigswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)inJiangxiprovince,wasORF7genepositivetestedbyRTPCR.TheresultofsequenceanalysisshowedthatORF7geneofthisstrainshared93.9%,69.8%homologieswiththoseofAmericanstandardstrainandEuropeanstrain.Brainsandlungsfromclinicalspecimenshadregularcytopathiceffect(CPE)over6passagesonMarc145cellculture,ORF7genecanbedetectedatcellcultures;sequenceanalysisofNsp2(nonstructuralprotein)geneshowedthattherewasahighaminoacidhomologybetweenJX0708andotherChineselocalPRRSVstrainsisolatedinrecentyears,whilethisstrainhad30aminoaciddeletionattheresidues482and533to561comparewiththeAmericanstandardstrain.Electronmicroscopydemonstratedthattypicalvirionsthwerefoundinthepurifiedcellcultures.Cellculturesof8passageswasusedtodoregressiontestonthepigletsof30dayold.Aftertheinoculation,allpigletsshowedtypicalclinicalsignsandpatiologicalchangesofPRRS.SoanAmericavariantPRRSVstainwasisolatedsuccessfully,andnamedJX0708strain.Keywords:PRRSV;JX0708strain;isolationandidentification;Nsp2gene;analysisofgeneticvariation
