猪伪狂犬病病毒ln1301株的分离鉴定及其毒力基因遗传变异分析

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1、１０１６０单位代码：分类号Ｓ８５５．３学号：２０１２２００４５？ｆ賓審换硕±学位论文题目：猪伪巧犬病病毒ＬＮ／１３０１株的分离鉴定及其毒力基因遗传变异分析ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｔｅｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓｉｎＬＮ／１３０１ＰｏｒｃｉｎｅＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ研究生；董後萍导师：周铁忠学科专业：微生物学一２０论文谏题起止时间；２０１３年４月１５年３月Ｉ论文完成时间；２０１５年３月４’ｉ

2、ｊ辽宁医学院研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｌ乂标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含一为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。一申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担切相关责任。＞／扛论文作者签名：日期：迂宁医学院研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解巧宁医学院有关保护知识产权的

3、规定，即：研究生在攻读学位期间论文王作的知识产权单位属远宁医学院。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为辽宁医学院，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为巧宁医学院。学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查＾阅和借阅。学校可！（义公布学位论文的全部或部分内容保密巧容除外），Ｌ义采用影印、缩印或其他手段保存论文。＂论文作者签名：＾病指导教师签名：血足／目录一、摘要中文论著摘要１英文论著摘要３二、英文缩略语６Ｈ、论文前ａ７

4、实验材料与方法８实验结果１４職２３结论２４四、本研究创新性的自我评价２５五、参考文献２６六、附录综述２９在学期间科研成绩４０致谢４１个人简介４２·中文论著摘要·猪伪狂犬病病毒LN/1301株的分离鉴定及其毒力基因遗传变异分析目的对猪伪狂犬病病毒（PRV）辽宁株进行分离鉴定，并对其毒力基因遗传变异进行研究分析，旨在查明辽宁省猪伪狂犬病的传染来源及其病原变异等情况，为进一步建立有针对性的诊断与防制方法提供基础和依据。方法应用病理学观察，PCR检测对疑似病例进行诊断。应用非洲绿猴肾（Ve

5、ro）细胞分离培养，通过电子显微镜观察、病毒中和试验、聚合酶链反应、病毒TCID50测定和动物实验对所分离的病毒进行鉴定，应用PCR扩增基因、克隆测序及相关的生物软件分析对分离鉴定的PRVgE、TK毒力基因进行遗传变异分析。结果疑似猪伪狂犬病病例经病理学观察和PCR检测确诊为PR。病理学观察结果表明其主要剖检病变特征为脑膜、肺、肝、肾、脾、淋巴结的出血和灰白色坏死斑点；主要组织病理变化有非化脓性脑炎，间质性肺炎及上述器官的局灶性核碎裂性坏死和出血；免疫组织化学结果显示该毒株存在于多种器官，与上述发生病变的器官一致。采集确诊病猪脑组织病料接种的Ve

6、ro细胞培养16小时后出现典型细胞病变，电子显微镜下观察可见位于囊泡中呈近似圆形、有囊膜、150~180nm大小的成熟病毒粒子，与PRV标准血清中和试验可产生有效中和保护作用，病毒毒-6.565TCID价TCID50为1050/mL，致病性试验小鼠出现典型伪狂犬病症状和死亡，从死亡小鼠脑组织中经PCR检测到PRV基因。应用PRV标准株设计的引物对分离1到的病毒进行gE基因和TK基因的PCR扩增、T-A克隆、测序得到目的基因序列。通过上述基因的系统进化树分析表明该毒株与国内外参考毒株的同源性都在97%以上，与国内外参考PRVgE基因核苷酸序列分析结

7、果显示所分离的PRVgE基因存在第995位点由C-A的突变、第999位点由T-G的突变，TK基因没有突变，氨基酸序列比对结果显示存在1个氨基酸L-Q位点的变化，即由亮氨酸变为谷氨酰胺，TK基因没有缺失和变异。结论1、通过病理学观察并结合PCR检测，确诊了一起猪伪狂犬病病例，应用Vero细胞分离培养，病毒中和试验、电子形态学观察、基因检测等方法确认从辽宁省成功分离到一株猪伪狂犬病病毒野毒株，命名为PRVLN/1301株。2、成功扩增克隆出猪伪狂犬病病毒辽宁株PRVLN/1301的主要毒力基因gE和TK，通过序列和系统进化树分析表明该毒株与国内外参考

8、毒株的同源性都在97%以上，说明该毒株与其它地区毒株为同一来源，但存在部分位点的变异。关键词猪伪狂犬病病毒；辽宁分离株；分离鉴定；变异分