麻黄—附子药对配伍化学成分及代谢组学的研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文麻黄一附子药对配伍化学成分及代谢组学的研究ResearchontheChemicalconstituentsandMetabonomicsinHerbaphedraeandRadixAconitiLateralisCoupletMedicines课题来源：麻黄类药对组成规律的基础研究(国家自然科学基金，编号81030066)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院周慧芳谭晓梅中药学学术型硕士研究生中医药学院2013年5月27日广州硕士学位论文麻黄一附子药对配伍化学成分及代谢组学的研究硕士研究生：周慧芳指导教师：谭晓

2、梅研究员摘要研究背景与意义本文来源于国家自然科学基金重点项目一麻黄类药对组成规律的基础研究中麻黄．附子的研究。药对又称对药，是临床常用的相对固定配伍形式。研究单味药难以反映其在复方中的真实作用；而复方由于药味多，作用关系复杂，对其研究也难以得出准确结论。“药对”作为中药配伍中的雏形，对其研究恰好可以弥补上述研究的不足。因此，有必要对药对发展的历史进程及近现代研究进行系统的归纳与认识，以便对其规律进行更加深入的探究，科学地指导临床应用。麻黄一附子为临床常用药对，仅张仲景的著作中以麻黄一附子入药的方剂就有麻黄附子细辛汤、麻黄附子甘草汤、乌头汤、麻黄附子汤。麻黄一

3、附子在不同汤方中用药剂量和功效均不同，本文研究的麻黄一附子药对出自麻黄附子细辛汤。麻黄附子细辛汤主治风寒表实兼阳虚里热症。麻黄一附子一表一里、一虚一实，达到相辅相成的作用。“汉方不传之秘在于用量”，本文设定麻黄一附子不同配伍比例，通过测定麻黄一附子不同配比中主要有效成分的含量，及通过比较麻黄一附子不同配伍水煎液中麻黄指纹成分的变化和通过比较麻黄一附子配伍对肉芽肿致大鼠亚急性炎症模型尿液中生物标志物的变化，从体外化学和代谢组学两方面说明药对配伍的规律。摘要目的(1)通过测定麻黄一附子不同配比中主要有效成分的含量，定量研究麻黄一附子配伍主要化学成分的变化规律。(

4、2)通过比较麻黄一附子不同配伍水煎液中麻黄指纹成分的变化，进一步研究配伍对其他成分影响的规律。(3)运用代谢组学方法，通过比较麻黄一附子配伍对肉芽肿致大鼠亚急性炎症模型尿液中生物标志物的变化，探索配伍对代谢通路的影响。方法(1)本实验选取《伤寒论》麻黄附子细辛汤中麻黄、附子(69、1lg)设为麻黄一附子1：1，依据药对文献报道的配比上下成倍浮动，设计成三个配比即麻黄一附子(1：0．5、1：1、1：2)。制备麻黄、附子、麻黄一附子(1：0．5、1：l、1：2)和麻黄附子细辛汤煎液，采用HPLC法测定麻黄中主要有效成分去甲基伪麻黄碱(NMP)、去甲基麻黄碱(NM

5、E)、麻黄碱(E)、伪麻黄碱(PE)和甲基麻黄碱(ME)和附子中主要有效成分苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱的含量，比较麻黄一附子不同比例配伍前后水煎液中主要有效成分含量的变化。(2)采用HPLC通过梯度洗脱得到麻黄、附子、麻黄．附子(1：0．5、1：1、1：2)及阴性对照色谱图，用相似度软件对麻黄色谱图进行分析获得麻黄的共有模式，并确定其共有峰，通过紫外吸收色谱图确定其共有峰的成分，比较麻黄一附子不同比例配伍水煎液对麻黄指纹成分共有峰峰面积的变化率。(3)根据麻黄一附子具有抗炎作用选择肉芽肿致大鼠亚急性炎症模型造模，30只大鼠随机分组共分为5组即空白组、

6、模型组、麻黄组、附子组、麻黄一附子组，每组6只大鼠。共收集造模前和造模后6天尿液，尿液离心后进行衍生化，采用GC／MS对大鼠尿液中代谢物进行全波长扫描分析，将所得的GC／MS数据导入XCMS进行峰识别、峰对齐、扣除溶剂峰、杂质峰的处理。导出的数据进行峰面积归一化处理，生成包括样品名称、归一化峰面积的二维矩阵。利用SIMCA．P软件对大鼠的尿液代谢物谱进行主成分分析(PCA)和偏最小二II硕士学位论文乘法判别分析(PLS．DA)，PCA直观观察不同组的差异；PLS．DA进一步考察组间的区分程度，并根据代谢物的投影重要性(VIP)评价不同物质与分类的相关性程度，

7、以VIP值>1的代谢物作为潜在生物标志物。运用SPSSl3．0软件对潜在生物标志物进行统计分析，选择差异有统计学意义的物质作为最终的生物标志物。通过与对第3天的空白组、麻黄组、附子组、麻黄附子组与模型组分别进行PLS-DA分析，分析具有显著差异的生物标志物，通过数据库鉴定出内源性标志物，结合现有的知识阐明麻黄一附子配伍前后所影响的代谢通路。结果(1)与麻黄单煎液相比，麻黄一附子配伍后不同程度地影响麻黄中五种生物碱的含量，其生物碱的溶出率与附子在药对中所占的比例有关，比例越大，溶出率越小。其中麻黄一附子1：1、麻黄一附子1：2组五种生物碱含量均显著降低(P<0

8、．05)。水煎液中去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄