靶向sirna体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞mas 基因表达的研究

《靶向sirna体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞mas 基因表达的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中图分类号：R363硕士学位论文靶向siRNA体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS基因表达的研究院（系）、所临床医学院研究生姓名张奉莲学科、专业内科学导师姓名刘建教授二Ο一三年四月1目录1靶向siRNA体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS基因表达的研究…………………………………………………………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………………………………………71.4材料与方法……………………………………………………101.5结果

2、……………………………………………………………231.6讨论……………………………………………………………271.7结论……………………………………………………………341.8参考文献………………………………………………………351.9英汉缩略词对照表……………………………………………422致谢……………………………………………………………433siRNA的合成及导入方法研究进展（综述）………………442靶向siRNA体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS基因表达的研究摘要目的：探讨体外直接转染以大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）M

3、AS基因为靶标的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）后，NRK-49F的MAS基因的mRNA表达和蛋白水平是否受到抑制，筛选出高效的siRNA，为进一步研究MAS基因在肾脏疾病中的作用机制提供实验基础。方法：（1）靶向MAS基因的siRNA的设计及合成：通过NCBI检索大鼠MAS基因序列，按照siRNA序列设计原则设计并合成特异性沉默MAS的siRNA3对：siRNA-1（5'-CCUGACCAGAGCUUUCAAATT-3'，5'-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3'）、siRNA-2（5

4、'-GACCAAUCAAAUAUGACAUTT-3'，5'-AUGUCAUAUUUGAUUGGUCTT-3'）、siRNA-3（5'-GCCAUUACUACACAAUCGUTT-3'，5'-ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT-3'）；阴性对照siRNA（siRNA-neg）（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）1对。（2）细胞培养：NRK-49F细胞置于DMEM/F12培养基中（含有l0％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素），在37

5、℃、5%CO2的无菌培养箱中，用0.25%胰酶消化传代，待细胞悬液内的细胞呈对数生长后，将细胞制成51×10/ml的细胞悬液接种于6孔培养板进行实验。（3）实验分组:①MASsiRNA-1：加入含siRNA序列1的转染混合物（transfectioncomplexes，TC）；②MASsiRNA-2：加入含siRNA序列2的TC；③MASsiRNA-3：加入含siRNA序列3的TC；④阴性对照组（CG）：加入含siRNA阴性序列的TC；⑤空白对照组(NG)：1只加入转染试剂；每组设3个复孔。（4）转染：将HiPerFectTrans

6、fectionReagent12ul与无血清无双抗培养液混合，配成100ul转染液后，再加入终浓度为10nM的siRNA,两者混匀常温孵育5-10分钟。将转染混合物加入六孔板中，轻轻晃动保证转染混合物分布均匀，恒温箱中孵育，48小时后检测转染效率。（5）基因表达检测：应用反转录酶聚合酶链式反应（rever-setranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）与蛋白质印迹法（Westernblot）检测转染前后MAS的mRNA与蛋白表达的变化。（6）图像处理：采用QuantityOne4.4.

7、0软件测定各组灰度值。（7）统计分析：应用软件spss17.0进行统计学分析，通过单因素方差分析检验各组间差异性，P<0.05视为有统计学意义。结果：经siRNA干扰后，3条靶向siRNAs均能不同程度的抑制MAS基因的表达。RT-PCR方法检测结果显示siRNA-1组、siRNA-2组及siRNA-3组NRK-49F细胞MAS的mRNA水平与空白对照组相比显著降低(P〈0.05),各组MAS与GAPDH灰度值的比值分别为0.5772±0.0220，0.3380±0.0434，0.6164±0.0767，抑制率分别达到26.89％，

8、57.12％，21.73％，而阴性对照组和空白对照组之间mRNA的表达水平比较则无显著下降。Westernblot方法检测结果显示：3条靶向MAS的特异性序列siRNA蛋白表达水平与空白对照组相比显著降低(P〈0.05)，抑制率分别为