《正肝方影响肝癌前病变afp依赖机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
湖北中医药大学学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖北中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：—争诜加、乃年1)月弓日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解湖北中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部份内容，可以采用复印、缩印或其他手段保留学位论文；学校可以根据国家或湖北省有关部门的规定送交学位论文。同意《中国优秀博硕士论文全文数据库出版章程》的内容。同意授权中国科学技术信息研究所将本人学位论文收录到((中国学位论文全文数据库》。(保密论文在解密后遵守此规定)论文作者签名壤锄导师签名：砷弓年易月弓日 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．IIl第一部分正肝方对表达AFP的人肝癌HEPG。细胞的影响⋯⋯⋯．．31材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯531吉j畏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．155{，寸论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16第二部分建立AFP表达缺失的人肝癌HEPG：细胞系⋯⋯⋯⋯．．21i材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．264小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．345讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．34第--盘．B分不同浓度外源性AFP对AFPSIRNA-HEPG：细胞系的影响。．．381材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．382方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．404小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．445讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45第四部分正肝方影响HEPG。细胞系的AFP依赖机制研究⋯⋯⋯．491材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．493结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．514小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．545讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯62 创新点．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63问题与展望．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．64参考文献⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．⋯．．．．．．．．．．65文献综述⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72附录一在校期间参加学术会议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．78附录二在校期间发表学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．79致谢。。⋯．．．．．⋯．．．．⋯．．．．⋯．．．．．⋯．．．．．⋯。．．．．．．．．．80 中文摘要目的：基于甲胎蛋白(AFP)对肝癌的发生发展及预后判断具有重要意义，以及前期正肝方具有较好防治肝癌前病变的临床及实验研究结果，本文应用RNAi技术构建AFP表达缺失的人肝癌HcpG：细胞系(AFPsiRNA-HepG：细胞系)作为研究工具，观察AFP对肝癌细胞系HepG：的影响，以及正肝方对表达AFP肝癌细胞系和AFPsiRNA-HepG：细胞系的药效学差异，从而阐释正肝方影响肝癌前病变的AFP依赖机制是否是其防治肝癌前病变的重要药理机制。方法：本论文分为四个部分。1．制备正肝方药物血清，应用Alamarblue方法筛选药物血清作用浓度及药物作用时间，干预人肝癌HepG：细胞系，MTT法检测细胞增殖情况，试剂盒法测GGT水平，化学发光法和Westernblot法检测AFP的表达，Hoechst33258染色观察细胞核形态，流式细胞术检测细胞的周期及凋亡，RT-PCR检测细胞端粒酶逆转录酶基因的表达。2．通过https：／／rnaidesigner．invitrogen．com／rnaiexpress／网站软件设计基因干扰靶点序列，模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5’端添加T，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加AGCT，与XhoI酶切后形成的粘端互补。正义链：5’一T一(ON，s)一(TTCAAGAGA)一(N。。C)-TTTTTTC-3’，反义链：3’一A(CN。s)一(AAGTTCTCT)一(N，。G)一AAAAAAGAGCT-5’。按此规则选择4个干扰靶点，分别记为AFP-639，AFP-1020，AFP-1432，AFP-1811。合成靶点序列，构建并鉴定质粒，包装、纯化病毒载体，转染，细胞计数计算感染效率，Westernblot及PCR检测各组AFP基因及蛋白的表达情况。选择干扰效率最高组，大量病毒包装构建hFPsiRNA-HepG：细胞系，Westernblot及RT—PCR检测AFPsiRNA—HepG：细胞及其传代后AFP基因及蛋白的表达。3．不同浓度外源性AFP干预AFPsiRNA-HepG：细胞系，MTT法检测细胞增殖情况，试剂盒法检测GGT水平，流式细胞术检测细胞的周期及凋亡，RT-PCR检测细胞端粒酶逆转录酶基因的表达。 4．将AFPsiRNA-HepG：细胞分为8组，按5％正常大鼠血清、5％药物血清、10％正常大鼠血清、10％药物血清、AFP+5％正常大鼠血清、AFP+5％药物血清、AFP+10％正常大鼠血清、AFP+10％药物血清加入干预，24h后，MTT法检测细胞增殖情况，试剂盒法检测GGT水平，流式细胞术检测细胞的周期及凋亡。结果：1．hlamarblue结果提示，20％血清浓度组正常大鼠血清及中药大鼠血清有明显细胞毒性作用，所以选择5％、10％两个浓度组进行后面的实验。药物干预时间为24h后；与正常大鼠血清组比较，5％、1o％药物血清组有显著阻滞细胞周期，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并下调细胞AFP基因及蛋白的表达，下调端粒酶基因的表达；5％、10％药物血清组显著改变细胞核形态结构，细胞核显著浓缩，并可见分叶状及碎片状细胞核；与正常大鼠血清组比较，药物血清组对细胞GGT的表达无影响。2．选择的四个靶序列，腺病毒少量包装后转染，通过计算各靶点感染效率，及细胞AFP基因及蛋白的表达结果，与野生型人肝癌HepG：细胞比较，靶点“AFP-639”干扰效率最高(97％)。选择靶点“AFP-639”构建细胞模型(AFPsiRNA-HepG：)，模型细胞传代后仍能稳定地沉默AFP基因及蛋白的表达，沉默效率达87％左右。3．大剂量AFP(100ug／m1)抑制AFPsiRNA-HepG：细胞增殖，阻滞细胞周期，下调端粒酶基因表达，并诱导其凋亡，小剂量AFP(≤10ug／m1)能促进细胞增殖，缩短细胞周期。不同剂量AFP对细胞GGT水平无影响。4．无AFP共同干预时，与正常大鼠血清组比较，5％、1O％药物血清组对细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡及GGT水平均无影响。有AFP共同干预时，AFP+正常大鼠血清组比较，AFP+药物血清组将细胞周期阻滞于G。／G，期，显著抑制细胞增殖，延长细胞周期，诱导细胞凋亡；5％、10％药物血清组对细胞GGT水平无显著影响。结论：1．在体外实验中，正肝方药物血清显著下调肝癌细胞AFP的表达，抑制细 胞生长并诱导其凋亡。2．应用RNAi技术成功构建了AFP表达缺失的人肝癌模型细胞系(AFPsiRNA-HepG2)。3．低浓度AFP(≤20ug／m1)有促进AFPsiRNA-HepG：细胞增殖作用。4．正肝方依赖抑制AFP对肝癌细胞的促增殖作用防治肝癌前病变。关键词：肝癌前病变；正肝方；基因干扰技术；甲胎蛋白III IV AbstractTheMechanismResearchofZhengGanFangFormuIaReIyingonAFPagainstPrecancerousLesionofLiverSpeciaIity：InternaImediCiReoftraditionaIchinesemediCiReDirection：TheCIinicaIandbasiCstudyonthepreventionandtreatmentofliverdiseaseWiththecombinationoftraditionaIchineseandwesternmediCiRe．Author：YunRanSupervisor：DaGuoYangKeyWords：PrecancerousIesionofIiver：ZhengGanFangFormuIa：AlphafetaIprotein：RNAiObjective：RNAitechnologywasusedtoconstructthemodelcel1ine(AFPsiRNA—HepG2eel1ine)whichisoutofexpressionoftheAFPofHepG2cel1ine；ToinvestigateTheeffectsofexogenousalphafetoproteinonproliferationandapoptosiSinAFPsiRNA-HepG2cel1s；andfurtherexplorethespecificmechanismsofZhengGanFangformulaoninhibitingprecancerouslesionof1iver．Methods：ThiSpaperincludesfourparts．1．Thedrugserawascollectedfromrats．PreliminaryscreeningincytotoxicityanddensityofthedrugserawasdeterminedUSingthealamarbluemethod．HepG2cel1Swereculturedwithdrugsera，eel1proliferationwasassayedbyMTTmethod，GGTwasdetectedbyKitassay，ChemiluminiscencemethodandWesternblotassaywereappliedtodetecttheexpresSionofAFP．NuclearmorphometrywasinvestigatedbyIFA，eelcycleandapoptosiSwasassayedbyflowcytometry(FCM)，RealTimePeRwereapplledtodetecttheexpresSionofCelltelomerasegene．V 2．GenesequencetargetAFPwasdesignedfromthewebsitethatiShttps：／／rnaidesigner．invitrogen．com／rnaiexpress／．TheloopStructureinthetemplateusedTTCAAGAGAtoavoidaterminationSigna．PositiveSenseStrand：5-W-(GNI8)一(TTCAAGAGA)一(NI8C)一TTTTTTC一3’，AntisenseStrand：3’-A(CNI8)一(AAGTTCTCT)一(N18G)一AAAAAAGAGCT一5’．ChoosefourtargetspotS，namedAFP-639，AFP-1020，AFP一1432，AFP一1811．SynthesiSoftargetsequence，Buildandidentifyingplasmid，packagingandpurifingviralvector，Transfection，Cel1countComputingeffiCiencyofinfection，UseWesternblotandRealTimePCRmethodtodetectthegeneandproteinexpresSionofAFPinallgroups．Selectinterferewiththehighestefficiencygroup，LargeamountSofviruspackagebuildAFPsiRNA—HepG2eel1ines．Andtheexpressionof．thegeneandproteinexpresSionofAFPinAFPsiRNA—HepG2cel1andaftertheweddingwasdetectedbyWesternblotandRealTimePCRmethod．3．AFPsiRNA—HepG2ce11lineswereculturedwithdifferentlevelSofexogenousAFP．Cel1proliferationwasassayedbyMTTmethod，GGTwasdetectedbyKitassay；Thenucleusmorphologicalobservationwasinvestigatedbyfluorescentassay，Cel1cycleandapoptosiSwasassayedbyflowcytometry(FCM)，RealTimePCRwereapplledtodetecttheexpresSionofcel1telomerase．4．AFPsiRNA-HepG2cellswasDividedintoeightgroups：5％ofnormallybigratsera，5％ofdrugsera，10％ofnormallybigratsera，10％ofdrugsera，AFP+5％ofnormallybigratsera，AFP+5％ofdrugsera，AFP+10％ofnormallybigratsera，AFP+10％ofdrugsera，cultured24hours，CellproliferationwasassayedbyMTTmethod，GGTwasdetectedbyKitassay，ChemiluminiscencemethodandWesternblotVI assaywereapplledtodetecttheexpresSionofAFP．NuclearmorphometrywasinvestigatedbyIFA，cel1cycleandapoptosiSwasassayedbyflowcytometry(FCM)，RealTimePCRwereappliedtodetecttheexpresSionofcel1telomerasegene．Results：1．Theresultsshowedthatconcentrationsof20％withnorma1lyratseraanddrugserahaveobviouscytotoxiceffect，SOtheconcentrationof5％and10％wereselected，andCiturefor24hourS：Comparedwiththegroupofnormallyratsera，theconcentrationof5％and10％druggroupshaveobviouseffectininhibitingcel1proliferation，blockingthecel1cycle，andinducingcel1apoptosiS，down—regulatingtheexpresSionofAFP，anddown—regularingtheexpressionoftelomerasegene；AndhaveobviouseffectonchangeingtheshapeandStructureofthenucleus；DrugserahavenoinfluenceontheexpresSionofGGT．2．Fourtargetsequenceswerechoesed，Adenovirustransfectionafterasmal1amountofpackaging，Computingefficiencyofinfection，detectingthegeneandproteinexpresSionofAFP，theresultSsuggestthatthetargetspotof“AFP一639"havethehighestinterferenceefficiency(97％)comparewithWildtypehumanhepatocellularcarcinomaHepG2cells．Sothetargetspotof“AFP一639"wasselectedtobuildcel1modelofAFPsiRNA—HepG2，themodelcel1SaftertheweddingcanStil1SteadySilencetheexpresSionofAFPgeneandprotein．3．HighdoseAFP(100ug／m1)caninhibitAFPsiRNA-HepG2cel1proliferation，blockthecel1cycle，cutthetelomerasegeneexpresSionandinducecel1death，lowdoseAFP(≤10ug／m1)canpromotecel1proliferation，shortenthecellcycle．DifferentdoseⅥI AFPhavenoinfluenceontheexpresSionofGGT．4．Comparedwiththegroupofnorma1lynorma1sera，theconcentrationof5％and10％drugserahaveobviouseffecttoinhibitcellproliferation，blockthecellcycleinGo／G1，Speriod，prolongthecel1cycle，Significantlyinducedcel1death，SignificantlycutthetelomerasegeneexpresSion，theconcentrationof5％and1O％drugseragroupshavenosignificantlyinfluenceontheexpressionofGGT．Conclusion：1．ZhengGanFangFormulahasobviouseffectonreducingtheexpressionofAFP，inhibitingcel1proliferation，blockingthecel1cycle，andinducingcel1apoptosiSofHepG2cel1Sinvitro．2．RNAitechnologycanbeusedtobuildHepG2cell1ineoutofexpresSionofAFP．3．Thelowconcentrationofhaseffectonpromotingcel1proliferationofAFPsiRNA—HepG2cel1S．4．ZhengGanFangFormulapreventandtreatprecancerouslesionof1iverthrougrestrainingtheeffectonpromotingcel1proliferitionofAFP． 缩略语HCCAFPTLMARNAIGGTPCDPBSDMSOMTTFCMPIRnaSe主要缩略语英文全称Hepatocel1ularcareinomaA1phaFeta1ProteinTelomeraSeRNAinterferene中文全称肝细胞性肝癌甲胎蛋白端粒酶基因干扰Gamma—glutamyltranspeptidaseY谷氨酰基转移酶Programmedeel1deathPhosphateBufferedSaliHeDimethylSulPhoxideMethylThiazolylTetrazoliumF10wCytometryPropidiumIodideRibonucleaseODOpticalDensityPSPCRRT-PCRTERTPhosphatidylserinePolymeraseChainReactionRealtimefluorescentquantitativePCRTelomerasereversetranscriptasesubunitIX细胞凋亡磷酸盐缓冲液二甲基亚砜甲基噻唑基四唑流式细胞术碘化丙啶核糖核酸酶吸光度磷酯酰丝氨酸聚合酶链反应实时荧光定量PCR反转录酶样蛋白 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究引言肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是世界上常见的恶性肿瘤之一，它是一种恶性程度高、进展快、预后差的恶性肿瘤，其全球发病率和死亡率分别列所有肿瘤的第7位和第4位【11。2002年全世界新发病例约625000例，近年来HCC的发病率在许多国家呈上升趋势，引起社会的广泛关注【2，3，41。我国为肝癌的高发区，其中50％以上的HCC发生在我国【51，肝癌一旦发生，治疗非常困难，预后极差，5年生存率不超过5％。随着肝癌病因及发病机理研究的不断深入，取得了一些突破性的进展，研究发现肿瘤的发生与人体的免疫、基因等多种因素有关。近日有报道上海复旦大学肝癌研究所汤钊猷院士等最新研究建立了能正确预测肝癌病人有无转移可能的分子模型，肝癌术后是否转移可以通过此模型进行预测，准确率高达90％以上【6】。对于肝癌治疗亦取得了一些进展，有报道在动物实验中Y-INF联合TNF能有效治疗肿瘤，这种联合治疗方案对肝癌的作用效果还有待进一步研究明确n1；手术切除治疗及放化疗等西医治疗手段虽取得一定疗效，但费用昂贵，复发率高，且患者生活质量较差。总之目前仍未发现肝癌发生的有效预测方法及治疗肝癌的理想药物。因此，积极预防肝癌、阻断肝癌发生对于肝癌的防治显得至关重要。肝癌前病变是指病理上易发生癌变的肝组织异常，一般认为在慢性肝病中出现的肝细胞不典型增生、腺瘤样增生、肝细胞再生结节、肝细胞小管状化生和卵圆细胞增生，与肝细胞癌变发生关系密切，被认为属于肝癌前病变范畴【7】。肝癌前病变是肝癌发生的必经阶段，如能逆转或中断肝癌前病变的病理进程，则可有效预防肝癌发生，可减少患者手术及放化疗的痛苦，并可减轻患者经济负担，带来较大的经济效应。近年来，对肝癌前病变的研究显示，西医仍缺乏理想的阻断或逆转病变手段，而研究发现中医药在预防肝癌发生，减少复发、提高生存质量、延长生存期等方面有着独特的优势。且中药因其资源丰富、副反应较小、价格低廉，呈现出较好的研究前景。其对肝癌前病变的防治作用倍受期待，成为目前肝癌防治研究的重点。 湖北中医药大学2013届博士学位论文AFP作为肝癌标志物，对肝癌的发生发展至关重要，70％以上的肝癌前病变患者伴有AFP升高。就AFP对肝癌细胞的影响，学者们进行了大量的临床研究及体内外基础研究。发现了一些AFP对肝癌细胞的影响效应及作用机理。主要包括：①调节细胞生长作用。②免疫抑制作用。肝癌的发生存在AFP依赖机理。正肝方是导师杨大国教授从事肝病临床工作30多年来基于肝癌前病变“气阴不足，湿、热、瘀、毒相互夹杂"的基本病机而成，具有扶正祛邪的功效，改善患者身体素质。长期应用于临床，治疗肝癌前病变患者，即肝硬化伴高甲胎蛋白血症患者，取得较好疗效，其能显著降低患者血AFP水平，阻止肝癌发生且预防肝癌术后复发。临床临床研究发现【8】，正肝方治疗肝硬化伴高甲胎蛋白(AFP)血症患者取得较好疗效，可较快降低肝硬化患者的AFP水平。这显示出正肝方在防治肝癌前病变方面有一定的临床疗效。动物体内实验研究发现[9,10,11l，正肝方对黄曲霉素B1(AFB，)诱发大鼠肝癌前病变有一定的抑制作用，有抗肝损伤，保护肝功能作用；减轻大鼠癌前病变肝细胞的异常增生；抑制化学致癌物引起的肝细胞从启动到恶性表型的转化和肝细胞异常增生，达到预防肝癌发生的作用。但是该方的具体作用机制尚不清楚。因此，基于AFP对肝癌的发生发展存在至关重要的作用，以及正肝方能显著抑制肝癌前病变患者AFP水平，阻止肝癌发生疗效的工作基础，考虑正肝方防治肝癌前病变可能存在AFP依赖机制。本研究拟体外验证正肝方对人肝癌HepG：细胞的影响；应用RNAi技术构建AFP表达缺失的人肝癌HepG：细胞模型；观察在有和无外源性AFP的干预下，正肝方药物血清细胞周期，细胞增殖，细胞凋亡等的影响，以明确正肝方防治肝癌前病变是否是通过影响AFP依赖机制。本研究完成以后，将进一步验证正肝方对肝癌发生的预防作用，并揭示主要作用机理。为该方的进一步优化研究，奠定坚实的理论基础。 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究第一部分正肝方对表达AFP的人肝癌HepG：细胞的影响1材料1．1细胞人肝癌HepG：细胞购自中科院上海细胞所。以含10％FBS的DMEM培养基，放置于37℃，5％C0：培养箱常规培养。1．2动物雄性SD大鼠10只，160-1709，清洁级，中国科学院上海动物实验中心提供，合格证号SCXK(沪)2009-0009。饲养于上海中医药大学动物实验中心，自由饮食饮水。1．3药物正肝方由黄芪、丹参、鳖甲、女贞子、半枝莲等组成。以上各单味药均为免煎中药浸膏粉，每克粉剂相当于生药5克，由广州一方制药公司提供。临用时将各单味药粉按比例称取，用双蒸水溶解配成o．69／ml的中药水剂。1．4主要试剂DMEM、胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)购自GIBCOTM公司；胰蛋白酶，购自罗氏(中国)有限公司；无EDTA胰酶、细胞裂解液、Hoechst33258，均购自上海碧云天生物有限公司；MTT，购自Sigma公司；AFP一抗(Cat#3903)购自CeliSignalingTechnology公司；AFP化学发光酶免疫法检测试剂盒购自新湾生物科技有限公司；细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinV-FITC及PI)，均购自BD公司；Alamarblue，购自上海碧云天生物有限公司。端粒酶引物由大连宝生物公司合成(见附表1-1)。 湖北中医药大学2013届博士学位论文1．5常用试剂配制方法(1)DMEM培养基IL：DMEM干粉1袋，NaHCO，2．29，HEPES2．389，青霉素0．06259，链霉素O．19。(2)胰酶1L：Trysin2．59，EDTA0．29，NaCl89，KClO．49，Na2HP04·12H200．1349，KH2P040．069，NaHC030．359。(3)L一谷氨酰胺IL：L一谷氨酰胺29．209、ddH：0至1000ml。(4)PBS缓冲液1L：NaCl89，KCl0．29，Na2HP04·12H203．589，KH2P040．269。1．6主要仪器OlympusIX70倒置显微镜、荧光倒置显微镜，购自日本奥林巴斯公司(Olympus)；Direct-Q。超纯水系统，购自美国密理博公司(mi11ipore)；5415R小型高速冷冻离心机，购自德国艾本德有限公司(eppendorf)；Gilson移液器，购自法国吉尔森公司；细胞培养箱、FinnpipetteFI套装移液器，购自美国赛默飞世尔科技有限公司(ThermoScientific)；BT223S电子分析天平，购自德国赛多利斯集团(sattotius)；THZ—c恒温振荡器，购自江苏太仓市实验设备厂；摇床TS-8型，购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；YC-1层析实验冷柜，购自北京德天佑科技发展有限公司；微波炉，购自美的公司(Midea)；TE70PWR半干电转印系统，瑞士安玛西亚有限公司(AmershamBioscience)；小垂直板电泳槽，PowerPac200电源，My-cyclel"Thermalcyclet购自美国伯乐公司(Bio-Rad)；数码凝胶处理系统，天能科学仪器；Rotor-Gene3000实时荧光定量基因扩增仪(PCR仪)，购自澳大利亚CorbettResearch公司；4 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究Odyssey红外荧光扫描成像系统，购自美国LI—CORBiosciences公司；PowerWaveXS微孔板分光光度计，购自美国伯腾仪器有限公司(BioTek)；NanoVue超微量分光光度计，购自美国通用电气医疗集团(GEHealthcare)。SpectraMaxi5，购自美国分子仪器公司(MolecularDevices)。2方法2．1制备药物血清sD大鼠进动物实验房适应环境3天后，随机将大鼠分为中药正肝方组和正常组，每组5只，分别用正肝方水剂和蒸馏水按10ml／kg灌胃，2次／日，连续3天，禁食12h。第4天一次灌胃全天量，1h后无菌条件下经下腔静脉采血，3000rpm离心15min，分离血清，血清经56"C灭活30min，无菌EP管分装，-20"C保存备用。2．2hlamarblue法检测不同浓度中药大鼠血清的细胞毒性细胞以浓度1×106／ml，100ul接种96孔板，待细胞贴壁后将细胞分为6组，每组设6个孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、i0％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清、20％正常大鼠血清、20％qb药大鼠血清，均含AlamarBlue的DMEM培养液，且每组均设置3个空白对照孔以不含大鼠血清的AlamarBlue+DMEM空白对照。分别在Oh、3h、6h、12h、24h、48h、72h7个时间点，NanoVue超微量分光光度计测定吸光度0D570、0D595。按照公式计算Reduce％=(117．2×A570—80．6×A595)／(155．7×A‘595-14．7×A‘570)×100％。2．3MTT法检测中药大鼠血清对细胞增殖的作用细胞以浓度1×10'／ml，100ul接种96孔板，待细胞贴壁后将细胞分为6组，每组设6孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、10％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM，培养24小时后，吸弃培养液，加入含O．5mg／mlMTT工作液，细胞培养箱孵育4h后，小心吸弃上清液，加入DMSO100ul／孔，至充分溶解，在微孔板扫描分光光度计上测定吸光度0D490。 湖北中医药大学2013届博士学位论文2．4试剂盒检测细胞上清液中GGT水平细胞以浓度1X106／ml，lml接种6孔板，待细胞贴壁后将细胞分为6组，每组设3孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、10％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM培养液。培养24h后，收集细胞上清并离心取上清，按照试剂盒操作方法测GGT的表达。2．5化学发光法检测细胞上清AFP的表达细胞以浓度1×106／ml，lml接种6孔板，待细胞贴壁后将细胞分为4组，每组设3个复孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、10％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM培养液。培养24h后，收集细胞上清，按试剂盒方法处理，SpectraMaxM，测定荧光强度，计算AFP值。2．6Westernblot检测AFP的表达细胞以浓度1×106／ml，5ml接种lOOmm培养皿，待细胞贴壁后将细胞分为4组，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、1o％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM。培养24小时后，抽提细胞内总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，取40ug总蛋白，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移至硝酸纤维素膜上，Odessy封闭液封闭，与AFP抗体孵育，4℃过夜，洗涤后与HRP耦联二抗，室温作用2h。含TweenPBS洗涤4次，Li—CorOdyssey2．1软件下检测、定量、以GAPDH内参校正。2．7Hoechst33258测正肝方药物血清对细胞核的影响细胞以浓度1×106／ml，100ul接种96孔板，待细胞贴壁后将细胞分为4组，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、1o％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM。培养72小时后，轻轻吸尽培养液，100ui固定液室温固定15min。PBS洗涤后3次，100ulHoechst33258染色液染色15min，PBS洗涤3次，倒置荧光显微镜观察细胞核形态。2．8流式细胞术检测细胞周期细胞以浓度1X106／ml，lml接种6孔板，待细胞贴壁后将细胞分为4组，每组设3孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、1o％正 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM培养液。培养24h后，收集细胞上清，并收集PBS洗涤液，胰酶消化细胞，PBS洗涤细胞3次，70％L醇重悬细胞，置4度冰箱过夜固定细胞。固定好的细胞PBS洗涤后，RNA酶和PI染液混合液重悬细胞，并设置阴性对照。4。C避光孵育30min，流式细胞仪测定细胞周期。2．9流式细胞术检测细胞凋亡细胞以浓度1×106／ml，Iml接种6孔板，待细胞贴壁后将细胞分为4组，每组设3孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、10％正常大鼠血清、1o％中药大鼠血清的DMEM培养液。培养24h后，收集细胞上清，无EDTA胰酶消化细胞，收集并离心，预冷PBS两次重悬，弃上清，加入100ul结合液，AnnexinV-FITC和PI双染色(设阴性、Annexin-V—FITC和PI单染对照)，室温避光孵育15min，加入结合液稀释，流式细胞仪检测。2．10荧光RT-PCR检测端粒酶逆转录酶的表达细胞以浓度1×106／ml，iml接种6孔板，待细胞贴壁后将细胞分为4组，每组设3个复孔，分别加入含5％正常大鼠血清、5％中药大鼠血清、10％正常大鼠血清、10％中药大鼠血清的DMEM培养液。培养24h后，吸弃上清液，试剂盒法抽提．总．RNA，并取4ug．总．RNA逆转录成cDNA。由IulcDNA、10ulSYBR⑧PremixExTq2X、0．25uM上下游引物构成20uIPCR反应体系，95℃10s，4o个循环95℃5s，60。C25s进行PCR扩增。双标准曲线法分析其△△CT值。2．“统计学处理计量资料用X±S表示。所有数据均使用SPSS12．o软件进行统计学分析，计量资料组间比较使用单因素方差分析。P<0．05表示差异具有统计学意义。3结果3．1Alamarblue法检测不同浓度中药大鼠血清的细胞毒性hlamarblue方法是一种能透过细胞膜的无毒试剂，AlamarBlue中的蓝色无荧光树脂天青，进入细胞后，能被活细胞的胞质还原成有红色荧 湖北中医药大学2013届博士学位论文光的试卤灵。常被用于细胞活性及细胞毒性实验，其方便、快捷、可靠、安全。实验结果提示，20％血清浓度组正常大鼠血清及中药大鼠血清有明显细胞毒性作用；5％、10％浓度组，未见明显细胞毒性，与相同浓度正常大鼠血清组比较，在细胞培养6-48h时间段，5％、1o％中药大鼠血清均有显著抑制细胞增殖的作用(尸<防05)，且10％中药血清组较5％中药血清组有显著抑制细胞增殖作用(尸<矿彻。此实验指导以下实验选择5％、10％两个血清浓度组进行，且实验检测于药物干预24h进行。见表卜2、图卜1。表1-2药物血清对Hep(1：细胞活力的影响(x±s)时间5Ynormal10》6rDrmal20》6tarsal596drug10％drug20}6drugOh0．391±0．0050．368±0．0070．334±0．0070．376±0．0060．367±0．0060．326±0．0193h0．585±0．033o．447±0．0130．266±0．0180．553±0．0060．376±o．0150．250±0．0236h0．673±o．0130．546±0．0190．294±o．008o．625±0．004’0．456±0．009‘0．255±o．02612h0．638±0-0110-530-+o．0380．318±0．0230．592±o．003"0．460-+0．039’o．268±0．012‘24ho．543±0-0100．459±0-042o-302±0．0320．514±o．008’o-394±0．04Y0．261±0．039+48ho．438±o．0140．362±o．030o．259±o．006o-404±o．013"o．323±o-040"0．227±o．02472h0．362±0．007o．293±0．0060．233±0．0030．349±o-0120．262±o．0210．211±0．017与正常大鼠血清组比较，+尸<口O,qo0．800—0．700o0．600卜0．500—0．400F0．3000．2000．1000．000——●一5％Normal—_．卜10％Normal20％NormalOh3h6h12h24h48h72h图1—1：20％浓度血清组有明显细胞毒性，5％，10％两个浓度组，药物组在6-48h显著抑制细胞活力。8 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究3．2细胞增殖情况MTT比色法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，分光光度计测定0D490，吸光值可反映活细胞数量。MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。其灵敏度高、经济。广泛用于一些抗肿瘤药物的筛选等。本次试验结果提示，与正常大鼠血清组比较，5％、10％中药血清均能显著抑制细胞的生长(尸<现01)，见表卜3、图1-2。表1-3药物血清对HepG。细胞增殖的影响(X±s)组别OD值5％正常血清组5％药物血清组10％正常血清组10％药物血清组与正常血清组比较，+尸锄Ol。j％正常血清组j％药物血清组10％正常血清组10％药物血清组图1—23．3药物血清对HepG：细胞GGT的影响与正常大鼠血清组比较，中药血清组对GGT水平无显著影响(尸>O．05)。见表1-4。 湖北中医药大学2013届博士学位论文表卜4药物血清对HepG：细胞GGT的影响(x±s)组别G6T(II／L)5％正常血清组36．23士2．1135％药物血清组38．83土2．03510％正常血清组36．63土0．60110％药物血清组39．70±0．9523．4药物血清对HepG：细胞上清AFP表达的影响与正常大鼠血清组比较，5％、10％中药大鼠血清均能显著抑制HepG：细胞分泌AFP(尸<现01)；5％中药大鼠血清组与10％中药大鼠血清组无显著统计学差异(尸>现0．9。见表1-5，图1-3。表卜5药物血清对HepG。细胞上清AFP表达的影响(X±s)组别AFP(ng／mI)5％正常血清组364．32±12．6605％药物血清组109．63士8．634‘10％正常血清组374．60±9．70110％药物血清组100．51土12．667’与正常血清组比较，+尸锄Ol。P5％正常血清组5％药物血清组10％正常血清组10％药物血清组图卜33．5药物血清对HepG：细胞AFP蛋白表达的影响蛋白质印迹法即WesternBlot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种目的蛋白质半定量实验方法。其基本原理是通过特异10f。llll，l。lllllll，lll一0如弱∞弱如¨m5 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品的目的蛋白进行标记并着色。通过分析着色的位置和深度获得目的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。Westernblot结果提示：与正常组大鼠血清组比较，中药组大鼠血清均显著抑制HepG2细胞AFP的表达(P<现0／)；5％ee药血清组与10％中药血清组无统计学差异(尸>现05)。见表1-6，图1-4。表卜6药物血清对HepG2细胞AFP蛋白表达的影响(x±s)5％正常血清组5％药物血清组10％正常血清组1O％药物血清组与正常血清组比较，+尸锄Ot。5％iE常5％中药10％iE常1096中药图1—43．6药物血清对HepG2细胞核形态的影响细胞凋亡具有明显的细胞核形态学变化。Hoechst33258染色是一种经典的检测细胞核形态学的方法。Hoechst33258是一种特异性DNA染料，可作为荧光探针与DNA分子结合。细胞发生凋亡时，染色质会固缩，细胞核变形、缩小。Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。本实验结果显示，与正常大鼠血清组比较，5％、10％药物血清组均显著能改变HepG：细胞的细胞核形态及大小，5％、10％肿一 湖北中医药大学2013届博士学位论文药物血清两组细胞核明显浓缩，呈亮蓝着色，并可见分叶状或碎片状，为凋亡细胞。见图卜5。5％正常血清组5％药物血清组IO％／E常'gn清组10％药物血清组图卜53．7药物血清对HcpG：周期的影响一个完整的细胞周期包括G。／G。期、s期、G：／M期，各时期的DNA的含量均有不同，通常正常细胞的GI／c。期具有二倍体细胞的DNA含量，G：／M期具有四倍体细胞的DNA含量，s期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。流式细胞技术检测细胞周期的实验原理：PI与细胞DNA分子特异结合，且存在量效关系。通过流式细胞术检测与DNA结合PI的荧光强度，可以间接反映细胞内DNA含量的多少。因此，通过流式细胞技术PI染色法对细胞内的DNA含量进行检测，应用Modifit周期分析软件，可以明确各时相G。／G，期，S期和G：／M期的百分率。本实验应用流式细胞术检测细胞周期，结果提示，与正常血清组比较，5％、1o％药物血清组均有延长细胞周期的作用。见表1-7，图1-6。 表卜7药物血清对HepG：细胞周期的影响(xis)(％)与正常血清组比较，+尸锄Ol。●_——_-=缅硼腰IIl-■lI硼i_：l2L：：：二．．一⋯一．【d_L⋯⋯■S口∞Ⅲ_ 湖北中医药大学2013届博士学位论文可以染色凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于晚期凋亡细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，AnnexinV-FITC可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。流式细胞术检测，计算Q：+Q。，可以得到凋亡细胞百分比。本实验流式细胞术检测结果提示，与正常血清组比较，5％、1o％药物血清组均有显著诱导HepG：细胞凋亡(尸<现a／)。见表卜8，图1—7。表卜8药物血清对HepG：细胞凋亡的影响(x±s)(％)组别Qz+Q。5％正常血清组5％药物血清组10％正常血清组1O％药物血清组与正常血清组比较，’尸<口Ol。5％正常血清组5％药物血清组10％正常血清组10％药物血清组图卜73．9药物血清对HepG：细胞端粒酶基因表达的影响荧光RT—PCR结果提示，与正常血清组比较，5％、10％药物血清组均有显著抑制端粒酶基因表达(尸<现∥D。见表卜9，图卜8。 ．．垩堑查堕塑堑垄堕堕壅竺!!!堡塑垫型翌垄———————————————————————————————————————————————————————————————一表1_9药物血清对HepG：细胞端粒酶的影响(xis)5％正常血清组5％药物血清组10％正常血清组1O％药物血清组与正常血清组比较，’P<口Ol。●．● 加，细胞周期显著延长；且显著抑制细胞增殖。药物血清显著诱导肝癌细胞凋亡，下调肝癌细胞端粒酶逆转录酶基因表达。综上，正肝方防治肝癌前病变可能是通过抑制AFP的作用实现，其防治肝癌前病变可能存在AFP依赖机制。5讨论5．1延长细胞周期，抑制肝癌细胞生长是正肝方防治肝癌前病变的有效途径细胞周期是从上一细胞分裂结束到下一分裂终止的过程，它可反映了细胞的增殖情况。细胞周期按染色体形成，可人为划分为四期：DNA合成前期(G。期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G：期)及有丝分裂期(M期)，细胞依次经过以上四个时期而完成增殖。其中暂时脱离细胞周期不进行增殖的细胞称为G。期细胞。细胞在不同时相存在着与其增殖密切相关的物质代谢，其中G。期物质代谢活跃，进行RNA和蛋白质的合成，如果主要的RNA和蛋白质合成被抑制，就不能进入s期；s期以DNA复制、组蛋白合成及二者组装成核小体为特征，当S期细胞被DNA合成抑制剂作用时，组蛋白的合成也很快结束，而不能顺利进行下去，G：期主要为进入M期做多种结构和功能的准备，每一个生命个体中，都存在细胞周期调控机制，它是一个决定细胞是否生长、何时开始生长、何时分裂或何时死亡的精密程序，其在相关基因的控制下，调控细胞的生长、分裂和死亡。真核细胞周期有2个重要的调控点，即G。／S和G：／M，其中G。／s点尤为重要，因为一旦细胞通过了此限制点，将会自主完成细胞周期而不再依赖外源性增殖分裂信号【121。恶性肿瘤细胞的无限制增殖与细胞周期的失控有关，细胞周期调控机制的破坏导致细胞生长失控，分化受阻，凋亡异常。细胞周期调控机制的破坏导致细胞的失控性生长，是几乎所有的恶性肿瘤的一个共同特征。近年来越来越多的学者注意到细胞生长周期的失调在肿瘤的发生中起着关键的作用。因此，肿瘤细胞细胞周期及其相关调控蛋白和信号机制成为了抗肿瘤细胞的研究热点。有文献报道[13,141，癌基因或抑癌基因突变的结果改变了细胞周期的调控，包括细胞周期启动、运行和终止的异常， 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究使本来应脱离细胞周期而停止增殖或应自行凋亡的细胞不断地进入细胞周期，从而出现无限制、自主的细胞增殖和分裂。传统中医药用于治疗肝癌取得一定成效，在抗肿瘤作用上备受关注，许多中药或其有效成分可阻滞肿瘤细胞周期于G1／s期，从而抑制癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。本实验结果显示，在正肝方药物血清作用下，HepG：细胞处于细胞间期G。／S期的比例显著增加，正肝方有显著阻滞细胞周期、延长细胞周期的作用；同时，MTT结果提示，正肝方药物血清能显著抑制细胞增殖。表明正肝方能通过影响细胞周期和抑制细胞增殖的途径防治肝癌前病变。5．2诱导细胞凋亡是正肝方防治肝癌前病变的有效途径之一细胞凋亡，即程序性细胞死亡(Programmedcel1death，PCD)，是生物体内广泛存在的一种由特定基因控制，以细胞DNA片段化为特征，无明显细胞溶解特征的自杀过程，是机体维持自身稳态的一种重要机制。细胞凋亡是一切生物正常胚胎发生过程和人类发育过程中细胞清除的正常途径。尽管凋亡是细胞死亡的一种生理途径，但它仍可以被各种病理性刺激引起。这一过程的紊乱将导致发育异常，并给人类造成许多严重的疾病。自1972年Kerr等【15】首先提出细胞凋亡的概念以来，随着对细胞凋亡分子机制的逐步认识，人们发现肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱有密切关系，细胞凋亡参与了癌症的起始过程，并对癌症的发生起负调控作用。进一步研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡是一条有效的对抗肿瘤的治疗途径，而癌前期细胞对细胞凋亡调控更为敏感，更易被清除，这是机体自我保护功能的表现。因此，如果能在肝癌前病变时期诱导不典型增生细胞凋亡，则能有效防治肝癌前病变，阻止肝癌的发生，下调肝癌发生率。本实验结果显示，正肝方药物血清显著诱导细胞凋亡。表明正肝方防治肝癌前病变的机制与其诱导肝癌细胞凋亡有关。5．3抑制端粒酶活性可能是正肝方防治肝癌前病变的有效途径之一端粒酶(Telomerase)是在细胞中负责端粒延长的一种酶，是一种核蛋白逆转录酶，它是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体。人的端粒酶由三个组分组成，即RNA组分(humantelomeraseRNAcomponent，hTR)、 湖北中医药大学2013届博士学位论文反转录酶样蛋白组分(humantelomerasereversetranscriptasesubunit，hTERT)及端粒酶相关蛋白1组分(telomeraseassociatedprotein1subunit，TPI)[16,17]。端粒酶能利用自身的RNA为模板合成端粒DNA，将端粒DNA加至真核细胞染色体末端，弥补随着细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒长度。端粒酶的存在，就是把DNA克隆机制的缺陷填补起来，即把端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使细胞分裂克隆的次数增加，延长细胞寿命。在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂克隆的细胞之中，才可以检测到具有活性的端粒酶。端粒对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，其能通过延长缩短的端粒而增强细胞的增殖能力。在正常人体组织中端粒酶的活性被抑制，但是在肿瘤中被重新激活，可能参与恶性转化，具有很高的肿瘤特异性。研究发现【181，端粒酶在多种人类恶性肿瘤中均有不同程度的表达，端粒酶的活化可使细胞发展成为永生化细胞，可能是恶性肿瘤发生中的一个共同途径。迄今发现85％-90％的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性，而大部分正常细胞不表达端粒酶。有关研究表明，端粒酶活性抑制所诱导的凋亡是p53非依赖的，可能是端粒酶活性抑制后影响到染色体的稳定性，由此激发某种非p53依赖的信号系统从而诱导了细胞的凋亡。研究还显示caspase家族可能参与了端粒酶RNA组分的反义寡核苷酸所诱导的凋亡。研究发现【19】端粒酶活性抑制诱导的凋亡过程中先发生GJM期的细胞周期阻滞进而发生凋亡。选择针对端粒酶合适的治疗方式既能高特异性杀死、杀伤肿瘤细胞，又不会对正常组织造成大的毒副作用。因此端粒酶可能是肿瘤靶向治疗的很好的候选位点。如果能够在转录水平有效地抑制hTERT基因的转录就可以有效抑制其活性，从而促使肿瘤细胞走向凋亡，则能有效的防治肿瘤，并阻止肿瘤的发展。本实验研究结果显示，正肝方药物血清能显著抑制肝癌细胞端粒酶基因的表达，能有效的抑制端粒酶活性，表明正肝方能靶向端粒酶，通过抑制端粒酶活性而防治肝癌，阻断肝癌进展。对于肝癌前病变患者，则能有效阻断肝癌的发生。 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究5．4正肝方显著下调HepG：细胞AFP的表达，正肝方防治肝癌前病变可能存在AFP依赖机制肝癌的发生存在AFP依赖机制。AFP是胚胎时期合成的蛋白质，婴儿出生2个月后逐渐下降到检测不到的水平，但是肝癌前病变及肝癌患者又恢复了其合成的能力，其作为肝癌标志物，对肝癌的发生发展及预后意义重大。就AFP对肝癌细胞的影响，学者们进行了大量的临床研究及体内外基础研究。发现了一些AFP对肝癌细胞的影响效应及作用机理。1998年ElenaDudich等【20】通过体外实验研究证明AFP能单独或协同生长因子对多种细胞的增殖有促进作用。并注意到AFP对肝癌细胞生长的调节有双向效应，即低含量的AFP(小于100ug／m1)能促进细胞增殖，但大剂量时(大于100ug／m1)，则可诱导细胞凋亡。但体内肿瘤所合成的AFP量小于100ug／ml，所以AFP在对肝癌前病变及肝癌患者主要表现为促进癌细胞生长的作用【211。进一步研究发现，在肝癌细胞膜上有2种不同亲和常数的AFP受体存在。AFP在肝癌时的高表达，可能是重要的内源性促肿瘤细胞增殖的自分泌现象。Uriel等【22】证明在人直肠癌、乳腺癌细胞和T淋巴细胞膜也有AFP受体的存在。推测AFP对细胞增殖分化的调节可能是由AFP受体介导。李孟森等【23】的研究结果显示AFP能显著提高NIH。T。细胞内的cAMP浓度、PKA活性和ca：+浓度，对p21ras的表达也有明显的促进作用；PTX能阻断AFP对NIH3T3细胞内的cAMP浓度和PKA活性的影响，而对AFP提高NIH。T。细胞内ca：+浓度、p21ras的表达则没有明显的阻断作用。AFP受体通过cAMP-PKA、ca：+等多信号转导途径调节NIH。T。细胞生长。新近研究表明【24】，AFP结构和成人血清白蛋白相似，是胎儿体内的主要蛋白质，具有免疫抑制作用，被认为是一种免疫抑制性蛋白质，它能有效抑制母体对胎儿的排斥，能抑制原发性肝癌病人和肝癌小鼠的免疫系统功能。这是由于AFP具有改变CD4+和cD。+等T淋巴细胞亚群的比例和导致淋巴细胞死亡的作用。用AFP基因的某些碱基片段作为表位目的基因，发现表达这些表位基因的蛋白质具有抑制T淋巴细胞的免疫应答功能【25】。AFP的高表达可能有直接抑制Fas表达的作用或通过突变型p53的表达可抑制Fas的合 湖北中医药大学2013届博士学位论文成，从而达到抑制肿瘤细胞凋亡和逃避机体的免疫监视[26】。本实验结果显示，正肝方显著下调人肝癌HcpG：细胞AFP蛋白的表达水平，且能延长细胞周期，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，据此推断，正肝方防治肝癌前病变可能是通过抑制AFP的作用实现的，可能存在AFP依赖的作用机理。 正堕．堕兰堑苎堕塑壅竺!!!堡塑垫型堡塞——————————————————————————————————————————————一一第二部分建立AFP表达缺失的人肝癌HepGz细胞系(AFPsiRNA—HepG2)1材料1．1细胞HepG：细胞和包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所。用含1O％FBs的DMEM培养基，放置于37℃，5％cO：培养箱常规培养。1．2主要试剂AFPsiRNA由英俊公司合成；质粒载体由上海比昂生物医药科技有限公司提供(详见图2—1)；AgaroseGelDNAPurificationKitVer2．0(TaKaRa)购自大连宝生物；大肠杆菌菌株DH5仅、DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、限制性内切酶均购自Invitrogen公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；质粒DNA提取试剂盒购自Axygen公司；制备感受态试剂盒购自BIoScIENcEs；凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司；1kb／100bp1adder购自Fermentas；AFP一抗(cat#3903)购自cel1SignalingTechn0109y公司；总RNA抽提试剂盒(cat撑w7001)购自上海华舜生物工程有限公司；逆转录试剂盒(cat社K1622)购自Fermentas；sYBR⑩PremixExTaqTM(Cat书DRR041A)购自Takara公司，DMEM、胎牛血清(FetalBovineserum，FBS)购自GIBc0珈公司。PcR引物由大连大生物公司设计合成(见表2—1)。表2—1：21 湖北中医药大学2013届博士学位论文岬．pro∞t”1堋322_orilSnPⅧJZ[52％i、g堆K呻I52∞peluelcr‘ptKS．pr抽”Sac[I50420f#c：!．i10nCqR．mCmlcerwjwl％"c,∽ter口叱～d．pMHIv．-．5．I_TR108R322一or／glnW—F吐prj∞’M—pronotfPEfiFP．M_prlner■_叽f-4—，：j=J：1IuEU●_i丁一j‘：：¨Iv一峨一NE$一l，-FOP■r∞n!i一、jrj14-．№●If6n∞)5"caI(zC4．x4)pUCl9l蛔卅HI(2}^h口I(21)辩vI(2-，，蛔小¨l‘3’)m1‘I-7‘0CMV图2—1^7r，，S醒，h口718(瑚●oH)Kpnl●44I“)^叩7I#(4-too)o酗】rt4^，)．sHI‘1727)／,stI(206"1)sty,,If2128)mI(2I：b，．即日I(2lH，)．‘r／x-If216¨gag日vI‘舶ml却*ⅥltⅫr7)^，I‘3497)船Ⅵ1(3526)lt、flt，，、’／／amIII(2)№l(21)趴I(21)B．m11103)肇’1(176)Sly1(3204)FroRI(3‘町)Ndc1(t967)NroI(2046}S，vI(2046)VSv．G，，州If223u)^印"／it((24∞)聊II(2463)眦If2㈨～蛆r嘲泖器∽¨H¨觳“ 正肝方防治肝癌前病变AFP依赖机制研究1．3主要仪器OlympusIX70倒置显微镜、荧光倒置显微镜，均购自日本奥林巴斯公司(Olympus)；Direct-Q，超纯水系统，购自美国密理博公司(mi11ipore)；5415R小型高速冷冻离心机，购自德国艾本德有限公司(eppendorf)；Giison移液器，购自法国吉尔森公司；细胞培养箱、FinnpipetteF1套装移液器，购自美国赛默飞世尔科技有限公司(ThermoScientific)；BT223S电子分析天平，购自德国赛多利斯集团(sartorius)；PowerWaveXS微孔板分光光度计，购自美国伯腾仪器有限公司(BioTek)；THZ-C恒温振荡器，购自江苏太仓市实验设备厂；摇床TS一8型，购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；YC-1层析实验冷柜，购自北京德天佑科技发展有限公司；微波炉，购自美的公司(Midea)；TE70PWR半干电转印系统，瑞士安玛西亚有限公司(hmershamBioscience)；小垂直板电泳槽，PowerPac200电源，My—cyclerThermalcycler购自美国伯乐公司(Bio—Rad)；数码凝胶处理系统，天能科学仪器；Rotor—Gene3000实时荧光定量基因扩增仪(PCR仪)，购自澳大利亚CorbettResearch公司；Odyssey红外荧光扫描成像系统，购自美国LI—CORBiosciences公司。2方法2．1干扰靶点的选择基因干扰靶点序列通过http：／／rnaidesigner．invitrogen．com／rnaiexpress／网站软件设计。模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5’端添加T，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加AGCT，与XhoI酶切后形成的粘端互补。正义链：5’一T一(GN，s)一(TTCAAGAGA)一(N，。C)-TTTTTTC-3’，反义链：3’一A(CN。。)一(AAGTTCTCT)一(N。sG)一AAAAAAGAGCT-5’。按此规则选择4个干扰靶点，分别为：AFP-639：5’TGGTCTATCTCCAAATCTAAACTTCAAGAGTTTAGATTTGGAGATAACCTTTTTTC3， 湖北中医药大学2013届博士学位论文3’ACCAGATAGAAATTTGAAGTTCTCTCAAATCTAAACCTCTATCTGGAAAAAAGAGCT5，AFP一1020：5’TGGTCTATCTCCAAATCTAAACTTCAAGAGAGTTTAGATTTGGAGATAGACCTTTTTTC3’3’ACCAGATAGAGGTTTAGATTTGAAGTTCTCTCAAATCTAAACCTCTATCTGGAAAAAAGAGCT5’AFP-1432：5’TGCCAACTCAGTGAGGACAAACTTCAAGAGAGTTTGTCCTCACTGAGTTGGCTTTTTTC3’ACGGTTGAGTCACTCCTGTTTGAAGTTCTCTCAAACAGGAGTGACTCAACCGAAAAAAGAGCT5’AFP一1811：5’TGGAAGTCTGCTTTGCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGCAAAGCAGACTTCCTTTTTTC3’3’ACCTTCAGACGAAACGACTTCTAAGTTCTCTAGAAGTCGTCTGAAGGAAAAAAGAGCT5，2．2靶点序列的合成上述4组靶点序列由英俊公司负责合成。2．3构建质粒将DNAoligo分别用TE(19H8．0)溶解，浓度为100uM。取相应的正义链和反义链oligo溶液各5ul，加入10XshDNAAnnealingBuffer，双蒸水至50ul体系。在PCR仪上按95。C5min；85。C5min；75。c5min；70。C5rain；4。c保存。退火处理后得到浓度为10uM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释5o倍，终浓度为200rN，用于连接反应。另外，取1oug19P1l3．7载体10ug，10×BufferR10ul，XhoI酶5ul，H19aI酶2ul，加双蒸水至100ul体系，37。C酶切1小时，琼脂糖电泳，使用AgaroseGelDNAPurificationKitVer2．o(TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng／ul。最后按10×T4LigationBuffer2ul，19113．7(XhoI+n19aI)，shDNAteml91ate(100rg)，T4DNA1igase(5weissU／u1)各lul，加水至20ul，22℃反应1小时后转染JM109competentcel1s进行连接反应，每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50ug／mlAmpicil1in的LB培养集 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机常】研究中，然后使用碱裂解法抽提质粒。2．4质粒酶切鉴定2．3所得质粒分别用XbaI和NheI进行双酶切鉴定。2．5病毒载体的包装与纯化(制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。)慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为90％时；重新接种于25mL的15cm细胞培养皿，37℃，5％cO：培养箱内培养，细胞养到70％左右；制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；pRsv-REV10ug，pMDlg-pRRE15ug，pMD2G7．5ug，干扰质粒20ug(含绿色荧光蛋白GFP)，加入无菌水定容至1800uL，再加入CaCl：(2．5mol／L)溶液200uL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000uL，室温放置20～30min；当细胞密度达60％～70％时转染，将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS15mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次；每瓶细胞中加入含100mL／L小牛血清的细胞培养液15mL，继续培养48h；收集转染72h的293T细胞上清液；将收集的上清液于4℃，40009离心lOmin，收集上清液；将各种不同RNA干扰质粒上清液以O．45um滤器过滤；于40mL超速离心管中，4℃，25000r／min离心20min；500ulPBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜。2．6HepG2细胞病毒转染感染前一天将HepG：细胞接种到2个六孔细胞培养板中(含10％FBSDMEM)，每孔接种5×105个细胞，置于37℃、5％CO：培养箱培养；六孔板中细胞培养24小时后，细胞密度为60—75％，进行感染实验，感染实验分为A(空白对照组)、B(GFP)、C(AFP-639)、D(AFP-1020)、E(AFP一1432)、F(AFP-1811)组，细胞换液，吸弃培养基，分别添加1．0ml含2％FBS、不含抗生素的DMEM培养液；同时加入病毒粗提液500ul，24小时后弃上清液，换含IO％FBS的DMEM培养液，倒置显微镜及荧光显微镜下观察细胞。 湖北中医药大学2013届博士学位论文继续培养96小时后，收集细胞。2．7AFP蛋白表达检测免疫印迹法(Westernblot)。分别提取感染实验A(空白对照组)、B(GFP)、C(AFP-639)、D(AFP-1020)、E(AFP-I432)、F(AFP-I811)组细胞总蛋白，取30ug总蛋白于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移至硝酸纤维素膜上，Odyssey封闭液封闭，AFP一抗孵育，4℃过夜，洗涤后与HRP耦联二抗，室温作用lh，Odyssey仪器扫描，计算机计算灰度值，计算蛋白相对表达量。2．8AFP基因表达检测应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)。分别抽提感染实验分为A(空白对照组)、B(GFP)、C(AFP-639)、D(AFP-1020)、E(AFP-1432)、F(AFP一1811)组细胞总RNA。逆转录试剂盒将总RNA逆转录为DNA模板，配制由模板、引物、SYBYmix反应体系后PCR扩增，得出“cT值。2．9建立AFP表达缺失的HepG：细胞系(AFPsiRNA-HepG：细胞系)根据上2．7及2．8中AFP蛋白及基因的表达情况，选取AFP干扰效率最高的靶点进行大量病毒转染包装细胞，得到AFPsiRNA—HepG：细胞系。2．10计学处理计量资料用x±S表示。所有数据均使用SPSS12．0软件进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析。P<0．05表示差异具有统计学意义。3结果3．1质粒用XbaI和NheI进行双酶切鉴定结果(图2-2) 正肝方防治肝癌前病变的AFP依赖机制研究图2—2：M：lamda／Ec01301：1-2为AFP-1811酶切结果；3-4为AFP一1020酶切结果；5—6为AFP一1432酶切结果；7-8为AFP-639酶切结果，所有质粒在1000bp大小的均为阳性重组载体。3．2测序鉴定结果A10一CS091217115—0787．C82-1．LV(100P)．Seq(AFP-1811)GAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAGTACCGGGCCCGCTCTAGAGATCCGACGCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTT7俐彳∥7℃丁杉f厂厂719C丁杉_彳C别77例彳C；爿l钳7l二7删倒彳么口捌l勿f厂丁l舅∥厂厂厂厂厂丁砑CGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTTCAACCCATTGGACGTCAATGGGGAG27 湖北中医药大学2013届博士学位论文TTGTTTTGCACCAAAATCAACGA11一CS091217115—0788．C83-1．LV(100P)．seq(AFP一1020)TACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGAcAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAGTACCGGGCCCGCTCTAGAGATCCGACGCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGT7∥∥7硎7F刀臼e4彳彳72：7×彳彳l：?77CAA口彳l剐∥7l—L乱劁厂厂刀口岔4f别7彳f纠l乃9厂厂厂厂厂71四CGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTAATGGGACTTTTCCTACTTGGCAGTACCATCTACGTATTAATCATCGCTATTAACAATGGGTGATGCGGTTTTGCCAGACCTACAATGGGCGTGGATAGGCGCTTTGACTCACGGGGATTCCAAGTCTCCCCCCCATTGAGCTCAATGGAGTTA06一CS091217115—0791．C84-2．LV(100P)．seq(AFP-1432)ACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAGTACCGGGCCCGCTCTAGAGATCCGACGCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCC飞飞GGkGkkkkGCC飞飞G飞飞豫CCAAcTCAGTGAGGACAAAc丁TCAAGAGAGTT他TCcZ(1AcTG 正肝查堕丝堑垄堕塑奎竺竺!堡塑垫型竺垄———————————————————————————————————————————————————————一AGTTGGCTTTTTTCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTCCAGTCTCCCCCCCATTGACGTCAATGGGGAGTTTGTTTGGCACCAAAAATCCACGGGACTTTCCCAAAAGGCGTA05一CS091217115—0792．C85-2．LV(100P)．Seq(AFP-639)CAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAGTACCGGGCCCGCTCTAGAGATCCGACGCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTT7黝∥77础A丁‘7f7’丁缎4彳彳l纠771鲋彳鲥GATGTTTGGAAGCATTCAAf7彬厂厂厂厂7’71饵CGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTCGCTTCACGAGATTCCAGCAGGTCGAGGGACCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGACAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGAAATGGCCCGCTGACATTATGCCCAGTACATGACTTATGGACTTTCCTACTTGCAGTACATCTACGTATAGTCATCGCTATACATGTGATGCGTTGCAGTACATCATGGGCGTGATAGCGTTGACTCAAG ————————————————_!!±垦苎垄兰!!!!壁堡主堂堡垒查GATTTCAGTCCCACCATGACGTCATGGGAGTTTGTTGCCAAAATCACGGACCTTCCAAATGTGTAACATT3．3转染后的HepG：细胞荧光图片荧光显微镜下可见转染后细胞核呈现绿色荧光。通过细胞计数计算感染效率，分别为GFP48％，AFP一63939％，AFP一102041％，AFP一143258％，AFP-181189％。见图2-3。图2-3，转染成功细胞可见绿色荧光。3．4RT—PCR检测各组转染后HepG：细胞内AFP基因表达情况PCR结果提示，639，1020，1811三个靶点AFP基因的表达显著下降。见2-4，图2—4、5。图2-4组别：NI，jnfectiOR；GFP；Shl，靶点639；Sh2，靶点1020；Sh3，靶点1432；Sh4，靶点1811。与正常组(野生型HepG：细胞)比较，4个靶点干预后细胞AFP基因的表达均有不同程度减少，但639靶点细胞AFP基因的表达相对最少，显著抑制了AFP基因的表达。30 表2-2各靶点细胞AFP基因的表达与正常对照组比较，靶点639，1020，1811显著下调AFP基因表达。O．60．50．4O．30．2O．1OAFP／B—actinHepG2GFP639102014321811图2-53．5Westernblot检测4组转染后模型HepG：细胞内AFP蛋白表达情况Westernblot检测结果提示：639，1020，1811三个靶点AFP蛋白的表达显著下降。见表2-3，图2-6。3l AFPGAPDH表2-3各靶点细胞内AFP蛋白的表达靶点GAPDHAFP／GAPDHNGFP63918111020143225．320．698．2610．418．149．2322．224．1432．8427．9114．8710．481．140．860．25’O．37‘0．54+O．88与正常对照组比较，靶点639，1020，1811显著下调AFP蛋白表达。N639102018111432GFP70KD36KD1．2lO．8O图2-6组别：NI，infection；GFP；Shl，靶点639；Sh2，靶点1020；Sh3，靶点1432：Sh4，靶点1811。3．6干扰效率根据上3．3感染率结果及上3．5AFP蛋白表达结果，以HepG2细胞组为对照，按(0．88-AFP／GAPDH)／感染效率。639干扰效率为：94％，1020干扰效率为：83％，1432干扰效率为：14％，1811干扰效率为：33％。3．7实时荧光定量PCR检测639靶点转染后模型HepG：细胞AFP基因表达PCR结果提示，与正常组比较，模型细胞及模型细胞传代后AFP基因的表达均显著减少。见表2-4，图2—7。32 表2—4模型细胞AFP基因表达(x±s)组别AFP／p—actinHepG2M1M51±00．15±0．025‘O．16±0．015’1．2lO．8O．60．40．2O与正常组比较，+P
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