善胃ⅱ号方对大鼠胃癌前病变的抑制作用及其机制研究

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善胃Ⅱ号方对大鼠胃癌前病变的抑制作用及其机制研究作者：唐丽明，高世全，施伟东，李东华，袁红霞【摘要】目的研究善胃Ⅱ号方对胃癌前病变模型大鼠胃黏膜P16、rasP21蛋白的影响及其对胃黏膜病理组织学改变的影响。方法制备胃癌前病变大鼠模型（造模30周）。将130只雄性Wistar大鼠随机均分为4组，即空白组（20只）、模型组（30只）、西药组（40只）、中药组（40只）。除空白组外，其余各组大鼠制作胃癌前病变模型。造模30周后，空白组和模型组每日给予生理盐水灌胃，中药组和西药组大鼠分别给予善胃Ⅱ号方或维酶素灌胃6周，处死大鼠并取材。光镜下观察各组大鼠胃黏膜病理组织学改变；免疫组化法检测胃黏膜组织P16、rasP21蛋白表达水平。结果胃癌前病变模型大鼠胃黏膜P16表达显著降低、rasP21蛋白表达显著增高；中药组与模型组比较，P16显著增高；西药组与中药组比较，P16蛋白表达差异有统计学意义，rasP21蛋白表达差异无统计学意义。结论善胃Ⅱ号方可阻断胃癌前病变模型大鼠胃黏膜的腺体进一步肠化与异型增生。升高P16蛋白的表达、降低rasP21蛋白表达可能是其有效防治胃癌前病变的机制之一。【关键词】善胃Ⅱ号方；胃癌前病变；P16；rasP2111 　胃黏膜细胞癌变过程中存在多基因的变化及积累，是一个多基因多步骤渐进的过程。与其它恶性肿瘤一样，胃黏膜上皮细胞的癌变是一个渐进过程，常经历多年的持续胃癌癌前病变阶段，因此如何有效治疗和逆转胃癌前病变，是预防胃癌发生的重要途径。善胃系列方剂以中医理论为基础，依照中医方剂配伍的基本原则，针对胃癌前病变的主要病机，分别以活血解毒、养阴清热和益气养阴为主法，针对疾病不同的演变过程及证候情况施以不同的治疗法则，在临床实践中已取得了良好效果［1～4］。本研究旨在利用大鼠胃癌前病变模型，探讨善胃Ⅱ号方对胃癌前病变的治疗机理。　　1材料与仪器　　1.1动物健康SPF级Wistar雄性大鼠130只，体质量（250±15）g，由卫生部生物制品检定所动物中心提供。　　1.2试剂与仪器N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)为FlukA公司产品；P16、rasP21单克隆抗体均为美国Santacruz公司产品；兔SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；维酶素片为北海阳光药业有限公司产品（批号050224）。高速离心机HitachiHimac1R21型日本产品；电热恒温水浴箱HH.W21.Cu600型，上海产；光学显微镜OlympusBX60型，日本产品；轮转式组织切片机，莱佧2135型，德国。11 　　1.3中药制剂善胃Ⅱ号方由天花粉20g，玉竹15g，沙参15g，麦冬30g，赤芍15g等药味组成，由天津市南开医院研究所制成每毫升含1g生药的水煎液。　　2方法　　2.1动物分组将130只Wistar雄性大鼠随机分为4组，即空白组20只，模型组30只，中药组40只，西药组40只，除空白组对照外，其余三组进行造模，造模结束后，在相同条件下分笼饲养。　　2.2动物模型的建立给予大鼠100μg/ml的MNNG溶液灌胃，药量为20ml/kg，隔天1次，灌胃4周后，除自由饮用100μg/mlMNNG溶液30周外（每天更换），同时每只大鼠每3天给予1ml无水乙醇1次,每进食2d禁食1d，进食当天下午自由饮用20mmol/L(0.85%)脱氧胆酸钠溶液。每周用钳子夹住大鼠尾部一次，使之保持激怒、争夺状态，持续10min，持续30周。空白对照组10只，每天自由饮用自来水。上述各组均以混合饲料喂养30周。　　2.3治疗方法在造模30周结束后，中药组用1g/ml的善胃Ⅱ号方水煎液以17.1ml/kg的药量灌胃，1次/d；西药组将维酶素片研碎制成0.029g/ml的混悬液以17.1ml/kg灌胃，1次/d；两用药组用药时间均为6周。模型组和空白组以17.111 ml/kg生理盐水灌胃，1次/d；持续时间均为6周。　　2.4标本采集及病理组织学、免疫组化染色上述各组于第30周予10％水合氯醛(3ml/kg腹腔注射)麻醉后处死动物，暴露并游离胃将胃沿胃大弯切开，按照胃底、胃体、小弯、幽门、贲门处分别取材,4%中性甲醛固定，石蜡包埋,切片厚4～……6μm，HE染色，镜下观察病理形态学改变。另外行P16、rasP21免疫组化检测。　　2.5病理组织评分　　2.5.1病理组织学判断标准以出现胃黏膜上皮异型增生，肠上皮化生判断为胃癌前病变，诊断标准如下：(1)肠上皮化生：胃黏膜上皮细胞可见肠上皮的杯状细胞。(2)轻度上皮异型增生：鳞状上皮增厚，有一定异形性，基底膜完整，腺体明显增多，腺腔扩大，腺细胞核亦增多，异形性不明显。(3)重度上皮异型增生：鳞状上皮增厚，有一定异形性，偶见核分裂，基底膜完整，腺体明显增多，腺腔扩大，腺细胞核深染，有一定异形性，未见核分裂。　　2.5.2病理检验评定标准参照2006年上海全国第二届慢性胃炎共识会议通过的《中国慢性胃炎共识意见》进行诊断及分类，并分等级如下：非肠化及异型增生(-)；肠化(+)；轻度异型增生(++)；重度异型增生(+++)。11 　　2.5.3免疫组化的判断标准参照文献［5］制定如下：将染色强度打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。(染色深浅需与背景着色相比较)。再将阳性细胞所占的百分比打分［6,7］，按阳性细胞百分数和染色深度分别记分,随机选择5个视野计数阳性细胞,根据阳性细胞的百分数,无着色为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分，染色强度与阳性细胞百分比乘积进行计分，乘积大于3分为免疫反应（+）做为标准。　　2.6统计学方法统计方法以SPSS11.5统计软件分析，所有资料均进行统计学处理。多组数据比较用方差分析，如显示多组间数据差异有显著意义,则再进行两组间的统计学分析；两组间计量资料采用t检验。两组间率的比较采用卡方检验，等级资料采用秩和检验。　　3结果　　3.1动物死亡情况实验期间，空白组死亡2只，造模组死亡4只，中药组死亡4只，西药组死亡6只。　　3.2胃黏膜病理观察　　3.2.111 肉眼观察空白组胃黏膜呈粉红色，皱襞排列整齐，伸展性好，未见增生结节。造模组大鼠胃腔变形，胃黏膜呈灰白色，皱襞平坦，有2例增生结节。西药组黏膜较暗淡，较正常黏膜变薄，未见增生结节。中药组胃黏膜呈粉红色，皱襞排列规则，未见增生结节。　　3.2.2光镜下观察空白组大鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，腺体形态规则，大小一致，细胞呈单层柱状，胞浆透明或呈小空泡状，腺上皮和腺管分界清楚，固有层偶见炎性细胞浸润，黏膜肌层未见增生。造模组胃黏膜明显变薄，腺体排列紊乱，黏膜表面可见散在的陈旧出血点，上皮细胞形态大小不一，核浆比例增大，出现共壁或背靠背现象，黏膜肌层向黏膜层延伸。中药组胃黏膜腺体排列较整齐，细胞形态较均一，腺上皮和腺管分界清楚，炎细胞浸润主要局限于黏膜浅层，固有腺体保持完整。西药组胃黏膜幽门腺有部分萎缩，胃小凹延长，病变黏膜固有层内慢性炎细胞浸润，甚至有淋巴细胞聚集及淋巴滤泡形成，血管增生，腺上皮呈不同程度的变性、萎缩，并夹杂有不少杯状细胞。固有层内腺体数目减少，有时腺体呈囊性扩大或共壁现象，细胞形态大小不一，核浆比例失调。各组大鼠病理结果见表1。表1各组大鼠的病理评定结果（略）　　在阴性与阳性的计数比较中：中药组和西药组分别与模型组进行比较均有统计学意义，且在中药组和西药组的比较中，中药组亦优于西药组，差异显著有统计学意义（P<0.05）表2各组大鼠病理结果阴性与阳性的计数比较（略）　　3.311 免疫组化检验结果综合计分后，乘积大于3分为免疫反应（+）做为标准，中药组与模型组进行比较有统计学意义（P<0.01）；P16，中药组与西药组进行比较有统计学意义（P<0.01）结果见表3。rasP21组中药组与西药组比较无统计学意义（见表4）。综合计分后对积分的均数进行组间比较：中药组和西药组分别与模型组进行比较均有统计学意义（P<0.01），且在中药组和西药组的比较中，中药组亦优于西药组，差异显著有统计学意义（P<0.01）。结果见表5。表3各组大鼠胃黏膜P16免疫组化检验结果阴性与阳性的计数比较，表4各组大鼠胃黏膜rasP21免疫组化检验结果阴性与阳性的计数比较，表5各组大鼠胃黏膜P16、rasP21免疫组化检验结果积分均数的组间比较（略）。　　4讨论　　胃癌的发生发展是一个多步骤、多因素的复杂过程，目前认为,细胞癌变主要是由于基因异常表达,使细胞内蛋白质合成紊乱,细胞的生长、分化和调节系统失控而自主性生长的结果，细胞原癌基因的激活、抑癌基因的失活是其重要因素。抑癌基因在生物体内的作用是同癌基因相拮抗，维持细胞增殖的相对稳定。11 　　在抑癌基因中，P16基因作为一个直接参与细胞生长增殖的负调控基因，近年来日益受到重视［8］。研究证实它是一个多种肿瘤抑制基因与多种肿瘤的发生有关。P16基因表达产物P16蛋白是CDK4的抑制因子，通过与细胞周期素DI(cyelinDl)竞争结合CDK4抑制CDK4活性，从而阻止视网膜母细胞瘤基因产物Rb蛋白的磷酸化，未磷酸化Rb蛋白可结合到转录因子EZF-DNA复合物上，在启动子上阻断mRNA的转录，同时又可活化转录因子ATF，促进细胞分裂抑制因子的转录，使细胞分裂停滞于Gl/S关卡处。当P16基因出现异常时，失去对上述细胞生长的负调控作用，使Gl期细胞迅速进入S期，细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生发展［9，10］。　　rasP21是ras癌基因家族(H-ras、Ki-ras、N-ras)的一种共同蛋白质表达产物,它参与膜的信号传递,在细胞生长、分化中起重要作用。ras基因是最早被确定由突变方式激活的癌基因,最常见的突变点为H-ras第12位密码子，均为GGC突变为GTC,从而使编码的甘氨酸转变为缬氨酸,使其产物P21蛋白的结构发生改变,导致ras基因活化和过量表达。ras基因的点突变和高水平表达与细胞增殖密切相关,在胃癌及多种肿瘤的癌变中起重要作用［11］。11 　　胃癌前病变的发生多由长期饮食不节或情志失调所致，与素体脾胃虚弱也有一定关系。我们发现本病的病因病机是随着疾病的发展变化而相应地发生动态变化的，因此不能单纯用某一型来全面概括。根据正、邪、虚、实的相互关系，认为其发病早期，病变程度较轻时，多属于血瘀热毒(邪实)；发病中期，病变程度较重时，多属于阴虚有热(正虚邪实)；疾病进一步发展，发病后期，病变程度严重时，则属于气阴两虚(正虚)。以此为基础，针对疾病不同的演变过程及证候情况施以不同的治疗法则，研制了相应的“善胃I-Ⅲ方”中药。　　善胃Ⅱ号药物组成为天花粉、玉竹、北沙参、麦冬、赤芍、蚤休、蒲公英、夏枯草，全方功效为养阴清热，方中天花粉味甘、苦、酸，其性偏凉，既能滋养胃阴，养阴生津，又擅长清解胸胃之烦热，为方中君药；玉竹甘寒体润，能养阴润燥，生津止渴，具有清养而不碍邪的特性，善治胃阴不足燥热之症；麦冬甘寒质润，能养阴生津润燥并能清热，功善清养肺胃之阴;北沙参苦微寒，养阴润肺，益胃生津；蚤休微苦性凉，能清解热郁，消痈散结，凡一切痈肿疮毒，各种癌肿，皆可应用；蒲公英味苦甘性寒，长于清热解毒，散结消肿，消散滞气；夏枯草苦寒泄热，辛能散结，能清火散结(现代药理研究证实，夏枯草对动物某种移植性肿瘤生长有明显抑制作用，近年来在肿瘤治疗中，常加入本品，有一定疗效)，共为臣药；赤芍苦寒，清热凉血，散瘀止痛，为佐使药。全方既甘平滋养胃阴以治其“虚”，又活血化瘀清热以治其“实”，如此则补泻兼施，虚实并治，切中病机。　　本实验结果表明，善胃II号方在胃癌前病变的早期能够提高胃黏膜组织中P16蛋白的表达水平、降低组织中rasP21蛋白的表达，中药善胃II号方可能对抑癌基因及原癌基因有一个或多个靶点的调控作用；此外，还提示善胃方可能具有抑制胃黏膜组织的过度增殖，逆转肠化及异型增生，防止细胞失控性生长的作用。11 【参考文献】　［1］魏爱勤，魏秀芹，袁红霞.善胃I号方治疗血瘀热毒型胃癌前病变的临床疗效及对EGF、PCNA的影响［J］.新中医，2008，40（2）：32.　　［2］代二庆，赵占考，袁红霞.善胃Ⅰ-Ⅲ号方治疗慢性萎缩性胃炎胃癌前病变的临床研究［J］.中医药学刊，2004，22（4）：606.　　［3］袁红霞，高金亮.中医药阻断胃癌前期病变的临床与实验研究［J］.天津中医，2000，4：34.　　［4］袁红霞.善胃冲剂辨证治疗胃癌前期病变6例［J］.新消化病学杂志，1997，8：55.　　［5］许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准［J］.中国癌症杂志，1996，6(4):229.　　［6］纪小龙，尹彤.Bc1-2基因:从研究走向肿瘤病理诊断［J］.临床与实验病理学杂志，1999，15(4):343.　　［7］徐估，张楚，孙久运，等.Bc1-2,Bax,11 Ki-67在胃癌中的表达及意义［J］.肿瘤，2001，21(3):211.　　［8］马晋平，詹文华，许多荣，等.胃肠道肿瘤P16基因纯合性缺失的检测［J］.中华检验医学杂志,2000,23(5):280.　　［9］SerranoM,HannonGI,BeachD.Anewregulatorymotifincell-cyclecontrolcawingspecificinhibitionofcyclinD/CDK4［J］.Nature，1993，366(6456):704.　　［10］KambA,GruisNA.WeaverFeldhausJ.etal.Acellcycleregulatorpotentiallyinvolvedingenesisofmanytumortypes［J］.Science，1994，264(5157):436.　　［11］戴林，张学庸，王守东，等.胃癌组织中P53、rasP21表达与增殖细胞核抗原的关系［J］.解放军医学杂志，1997，22(5):355.11