鸭圆环病毒衣壳蛋白的原核表达及其间接elisa检测方法的建立

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究]：作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：事毖燕l纠p年石月Io日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交

2、论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：箩趣毙．躲礴洲妒年f月／，。日≥，也年6具I巾日万方数据四川农业大学硕士学位论文中文摘要根据本实验室提交的鸭圆环病毒(DuCV)GH01株基因序列信息，设计针对DuCVCapsid(Cap)基因的特异性引物，以实验室保存病料为模板，对DuCVGH01株Cap基因进行PCR扩增，并且开展了：DuCVGH01株

3、Cap基因特征分析、截断Cap基因进行原核表达，并对重组表达蛋白进行亲和层析纯化，以Cap蛋白作为包被抗原，建立了检测DuCV抗血清的间接ELISA方法，结果如下：1．DuCVCap基因的克隆及分子特征分析利用PCR方法对DuCVGH01株Cap基因全长进行扩增，构建Cap基因的T克隆重组质粒并进行酶切鉴定，测序正确后对Cap基因及其编码Cap蛋白进行特征分析。结果表明：通过PCR扩增获得DuCV完整Cap基因，并成功构建T克隆质粒(pMDl8一cap)，测序分析表明，Cap基因全长大小为774bp，

4、编码蛋白为257aa，分子量为29．7kDa，等电点(PI)为lO．79：编码的Cap蛋白有一个保守结构域，属于Circoviruscapsid家族；含有3个糖基化位点，21个磷酸化位点，5个可能的抗原表位，分别位于1～39、60～85、96～116、129一180、211~243等区域；无信号肽、跨膜区；二级结构预测其无规则卷曲较多，三级结构预测显示其同源建模只有一个合适模型，为猪圆环病毒Cap蛋白。系统进化树分析表明，鸭圆环病毒GH01株与番鸭FJFQ315株亲缘关系最近，与鹅圆环病毒及天鹅圆环病

5、毒亲缘关系较近，与鸡传染性贫血病毒关系较远。Cap基因密码子使用分析显示，存在密码子偏嗜性，其中GGG、CAA、AAG、rrA与TCA使用频率为零；亚细胞定位预测结果显示，DuCVCap蛋白主要定位于细胞核区域。2．DuCV截断Cap基因的克隆、原核表达及蛋白纯化根据实验室提交的DuCVGH01株完整Cap基因序列设计了针对截去核定位信号的截断Cap基因引物序列，以实验室保存病料为模板，对截断Cap基因进行PCR扩增，并将扩增的截断Cap基因克隆到pMDl8．T载体上，经双酶切和测序鉴定正确后，克隆到

6、表达载体pET-32a(+)，将获得的重组表达质粒转入表达菌Rosetta，通过对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间的优化，确定最佳表达条件并进行大量诱导表达，表达重组Cap蛋白经Ni．NTA柱亲和层析纯化，收集洗脱液，测定纯化蛋白浓度，利用SDS．PAGE分析纯化效果。结果表明：扩增出预期大小为567bp的DuCVGH01株截断Cap基因片段，且能成功连接到原核表达载体万方数据四川农业大学硕士学位论文pET-32a(+)，构建重组表达质粒pET-32a．cap；经过诱导条件的优化，最终确定了蛋白表达的

7、最优条件为：在30℃、IPTG诱导浓度为O．8mmol／L条件下诱导16h，蛋白表达量达到最高值；重组Cap蛋白以包涵体的表达形式存在，大小约为39kDa。纯化后的重组蛋白条带较清晰，浓度约为1．5mg／mL，DuCVCap蛋白的成功表达为后续试验莫定了坚实的基础。3．以Cap重组蛋白作为包被抗原检测DuCV抗血清的间接ELISA方法的建立与应用通过对最佳抗原包被浓度、血清最佳稀释倍数、最佳包被条件、封闭时间及最佳酶标抗体稀释倍数的优化，确定间接ELISA方法最佳工作条件，确定阴阳临界值，并对间接EL

8、ISA方法的特异性、敏感性和重复性进行检测，最后通过临床样本的检测，比较本研究建立的间接ELISA方法和传统PCR检测方法的符合率。结果显示，本试验建立的间接ELISA方法的最佳工作条件为：抗原最佳包被浓度为4p∥孔，血清最佳稀释倍数为1：40，包被条件为37℃包被lh后放入4。C冰箱包被过夜，封闭时间为1％BSA37。C封闭Ih，最佳酶标抗体稀释倍数为l：800，阴阳临界值为0．352。建立的间接ELISA方法检测其他鸭源病原血清时结果显示均为阴性，敏