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《雷帕霉素对iga肾病大鼠的治疗作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
万方数据分类号：R692密级：单位代码：学号：雷帕霉素对IgA肾病大鼠的治疗作用及机制研究10114B$2010034TheTherapeuticEffectandMechanismResearchofRapamycinonIgANephropathyRat究生：田继垡师：奎苤出教授型：型堂堂焦称：凼型堂向：竖功能丕全数基趟曼!喳废院：簋三!临废医堂院二。一四年三月教类名方学导位业究在研指学专研所 ㈣删万方数据学位论文独创性声明论文作者签名：洌，’、倔绎日期：一2口／≠年』-月27日学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签指导教师签(本声明的绎詈彩笤方日伊垆纱厂目 万方数据山西医科大学博士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅳ英文缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅷ前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1日Ⅱ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第一部分体内实验雷帕霉素治疗IgA肾病大鼠疗效观察及机制研究⋯⋯⋯．6实验一、雷帕霉素对IgA肾病大鼠体重、24小时尿蛋白及肝肾功能的影响⋯⋯．．7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．．．．．⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．19实验二、雷帕霉素对IgA肾病大鼠保护机制的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．37实验三、IgA肾病大鼠中mTORCl信号通路的研究⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50／=J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53第二部分体外实验雷帕霉素抑制大鼠系膜细胞增殖的机制研究⋯⋯⋯⋯⋯57实验一、雷帕霉素对大鼠系膜细胞增殖及细胞周期的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．64讨{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．69实验二、雷帕霉素对系膜细胞细胞周期蛋白的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71 万方数据山西医科大学博士学位论文材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯79讨{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯84实验三、雷帕霉素对mTORCl及MAPK／ERKl／2信号通路的影响⋯⋯⋯⋯⋯86材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯86结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯88讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．91／J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯94参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯95结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯99综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯100参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．108个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯115致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯118 万方数据山西医科大学博士学位论文雷帕霉素对IgA肾病大鼠的治疗作用及机制研究中文摘要IgA肾病(tgAnephropathy，IgAN)是以出现镜下血尿或肉眼血尿或蛋白尿、血清IgA水平升高、肾脏病理显示肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积，导致系膜细胞增殖和细胞外基质沉积为特征的一类肾小球肾炎。目前认为IgA肾病在世界各地都是原发性肾小球肾炎中最常见的类型，在确诊后5～25年内，约20％～-40％的患者不可逆地进展为终末期肾病(end-stagerenaldisease，ESRD)。本课题重点研究了雷帕霉素在IgA肾病大鼠模型中的治疗效果及作用机制，同时探讨雷帕霉素抑制系膜细胞增殖的机制以及对信号转导通路P13刚砧“mTOR和脚l<／ERKl／2的影响。第一部分雷帕霉素治疗IgA肾病大鼠疗效观察及机制研究目的：IgA肾病(IgAN)是世界范围内最常见的肾小球肾炎，因其发病机制不清，所以临床上尝试不同的治疗方法。本研究旨在探讨低剂量roTOR抑制剂雷帕霉素对IgA肾病大鼠模型的潜在的保护能力及可能的作用机制，为临床治疗IgA肾病提供新思路。方法：首先我们建立IgA肾病大鼠模型，大鼠分为4组：正常对照组(contr01)、正常对照+雷帕霉素组(control+Rapa)、IgA肾病组(IgAN)、IgA肾病组+雷帕霉素组(IgAN+Rapa)每组10只；雷帕霉素(1mg／kg／d)灌胃给药，持续4周，对照组给予等量生理盐水灌胃。每周测各组大鼠体重；分别于4、8、12、16周末，用代谢笼收集各组大鼠24小时尿液，采用丽春红S法检测24小时尿蛋白；16周末处死大鼠，分离血清，取材。采用DxC800型自动生化分析仪检测各项生化指标：冰冻切片免疫荧光观测IgA沉积；HE、PAS、Massion染色后进行肾组织形态学分析；BrdU检测系膜细胞的增殖；免疫组化法及Real-timePCR检测肾皮质TGF．p1、PDGF．B、0【．SMA、CollagensI和III蛋白及mRNA的表达；最后我们用免疫组化及Westernblotting检测了肾皮质pS6蛋白表达。 万方数据山西医科大学博士学位论文结果：1)雷帕霉素可以减少蛋白尿，预防血肌酐升高，同时对大鼠体重及肝功能无影响；2)雷帕霉素直接或间接干扰IgAN发展为终末期肾病CESRD)的多个关键环节：①减少了IgA的沉积、抑制系膜细胞增殖；②减少IgA肾病大鼠系膜细胞0t．SMA表达及细胞外基质collagenlII的分泌；③下调促纤维化生长因子PDGF·B和TGF-f)l的表达。3)IgA肾病大鼠中pS6表达升高，说明mTORCl信号通路被激活，S6磷酸化为pS6；雷帕霉素作为mTORCl的特异抑制剂，可以阻断其激活，抑制S6磷酸化。结论：在IgA肾病大鼠中mTOR通路被激活，早期小剂量应用mTOR抑制剂雷帕霉素可阻断mTOR通路；同时雷帕霉素减少蛋白尿及IgA的沉积，抑制肾小球系膜细胞(MC)增殖、细胞因子和细胞外基质(ECM)分泌及三者之间的相互作用，从而减缓IgA肾病大鼠的肾损伤。第二部分雷帕霉素抑制大鼠系膜细胞增殖的机制研究目的：IgA肾病以系膜细胞增殖为主要病理特点，所以我们培养大鼠系膜细胞，研究雷帕霉素抑制系膜细胞增殖的机制，以及其对信号转导通路P13K／Akt／mTOR和脚ⅪERKl／2的影响。方法：常规培养HBZY．1细胞，分为control组、PDGF组、RAPAInmol／L组、RAPA10nmoI／L组、RAPA100nmo儿组、RAPA1000nmoI／L组，MTT法检测24h、48h细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡；蛋白提取及Westernblotting分析肾皮质细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE、CDK2及CDK4表达；Westernblotting及RT-PCR检测p27蛋白及mRNA表达量：Westernblotting分析信号传导通路蛋白P．P70S6K／P70S6K、p-AKT／AKT、P．ERKl／2／ERKl／2的表达量。结果：1)雷帕霉素呈剂量依赖性的抑制PDGF引起的系膜细胞增殖，阻断细胞周期在G1期，但100nmol／L与1000nmol／L组并未见明显差异；雷帕霉素不影响系膜细胞的凋亡；2)雷帕霉素不影响PDGF组上调的CyclinD1、E及CDK2、Ⅱ 万方数据山西医科大学博士学位论文4表达量；但可以通过调控mRNA的转录，增加p27蛋白表达；3)雷帕霉素剂量依赖性的抑制PDGF引起的PTOS6K磷酸化，1000nmol／L抑制作用最强：10nmol／L及100nmol／L雷帕霉素对PDGF刺激升高的P．AKT及P．ERKl／2均未见显著影响，1000nmoI／L干预时，P．AKT、P．ERKl／2较10及100nmol／L组的蛋白表达量略有升高。结论：雷帕霉素通过mTORCl／P70S6K通路调控p27mRNA转录，增加其蛋白表达，从而抑制cyclinE．CDK2的活性，阻断细胞周期由G0-G1期进入S期，抑制细胞的增殖：在大鼠系膜细胞中，大剂量使用雷帕霉素(1000nmol／L)可能会反馈激活AKT及Ras／Raf／ERK，从而减弱雷帕霉素抑制细胞增殖的效果。关键词：雷帕霉素，mTORCl，IgA肾病大鼠，大鼠系膜细胞Ⅲ 万方数据山西医科大学博士学位论文TheTherapeuticEffectandMechanismResearchofRapamycinonIgANephropathyRatAbstractIgAnephropathy(IgAN)isthemostfrequentglomerulonephritisworldwide．Theprimaryformofthediseaseusedtobeconsideredquiteharmless．Now，IgANisrecognizedasamajorheakhproblembecause20tO40％ofpatientsprogresstoend-stagerenaldisease(ESRD)within20yearsofdiseaseonsetandanadditional20％exhibitprogressivekidneydamage．Thepresentstudywasdesignedtoexploretherenoprotectivepotentialoflow·dosemTORinhibitorrapamycininanIgAnephropathyratmodelandthepossiblemechanismofaction，atthesametimeexplorethemechanismofrapamycininhibitionmesangialcellproliferationandeffectonsignaltransductionpathwayP13K／AKT／mTORandMAPK／ERKl／2．PartoneThecurativeeffectobservationandmechanismresearchofRapamycintreatmentonIgAnephropathyratobjectiveIgAnephropathy(IgAN)isthemostfrequentglomerulonephritisworldwide．DifferenttherapeuticapproacheshavebeentestedagainstIgAN．Thepresentstudywasdesignedtoexploretherenoprotectivepotentialoflow-dosemTORinhibitorrapamycininanIgAnephropathyratmodelandthepossiblemechanismofaction．MethodsAiterestablishinganIgAnephropathymodel，theratswererandomlydividedintofourgroups：control，controlwithrapamycintreatment，IgAnephropathymodelandIgAnephropathymodelwithrapamycintreatment．Rapamycin(1．0mg／kgperday)wasdosedintragastrically．Thebodyweightoftheratswasmeasuredweekly．IV 万方数据山西医科大学博士学位论文Attheendof4，8，12，16weeks，a24一hurinecollectionwasobtainedusingmetaboliccages．Ponceau’SstainwasutilizedtOmeasure24一hurinaryproteinlevels．Theratsweredeeplyanesthetized，andtissuesampleswereprocessedandstoredat16weekend．HepaticandrenalfunctionwasdeterminedwithanDxC800autoanalyzer．Directimmunofluorescencetechniquewasusedtotesttheintensitiesoffluorescenceofmicekidneyfrozensections．ThecellmorphologicchangesofrenaltissuewereobservedbyHE、PAS、Massonstaining．ProliferationwasassayedviaBrdUincorporation．Real-timePCRandimmunohistochemistrywereutilizedtodetecttheexpressionofa-SMA，CollagenI，CollagenIII，TGF-plandPDGF．Westernblottingandimmunohistochemistrywereperformedtodeterminep-S6proteinlevels．ResultsLow—dosemTORinhibitorrapamycinpreventedanadditionalincreaseinproteinuriaandprotectedkidneyfunctioninamodelofIgAnephropathy．RapamycindirectlyorindirectlyinterferedwithmukiplekeypathwaysintheprogressionofIgANtoend-stagerenaldisease(ESRD)：1)reducedthedepositionofIgAandinhibitedcellproliferation；2)decreasedtheexpressionoffibrosismarkers：仪-SMA、typeIIIcollagen；and3)down—regulatedtheexpressionoftheprofibroticgrowthfactorsPDGFandTGF-D1．Theexpressionofp—S6wassignificantlyelevatedinIgANrats．ConclusionsThemTORpathwaywasactivatedinIgANrats，earlyapplicationofsmalldoserapamycincanblockmTORpathway．RapamycinreduceproteinuriaandIeadeposits，inhibitglomerularmesangialcell(Me)proliferation，cytokineandextracellularmatrix(ECM)secretionandtheinteractionbetweenofthem,slowtherenalinjuryoflgANinrats．V 万方数据山西医科大学博士学位论文ParttwoThemechanismresearchofrapamycininhibitiononratmesangialcellsproliferationObjectiveMesangialcellproliferationisthemainpathologicalcharacteristicsoflgAnephropathy，SOweculturedratmesangialcells．ThepresentstudywasdesignedtoexplorethemechanismofrapamycininhibitionmesangialcellproliferationandeffectonsignaltransductionpathwayP13K／Akt／mTORandMAPK／ERKl／2．MethodsCukureHBZY-1cellConventionlly,dividedintothecontrolgroup，PDGFgroups，RAPAlnmol／L、RAPA10nmoI／L、RAPA100nmol／L、RAPA1000nmol／Lgroup．MTTmethodtodetected24h，48hcellproliferation，thecellcycleandcellapoptosisweredetectbyflowcytometry；ProteinextractionandWesternblottinganalysisedtheexpressionofrenalcorticalcellcycleproteinCyclinD1，CyclinE，CDK2andCDK4；Real—timePCRandWesternblottingwereusedtodeterminep27mRNAandproteinlevels；Westernblottingdetectedtheexpressionquantityofsignalingpathwaysproteinp-P70S6K／P70S6K，p-AKT／AKT,p-ERKl／2／ERKl／2．Results1)RapamycindosedependentinhibitedthemesangialcellproliferationwascausedbyPDGF，blockthecellcycleinGO．G1phase，butin100nmol／Land1000nmol／Lgroupdidnotseeobviousdifference；Rapamycindidn’taffectmesangialcellapoptosis；2)rapamycindid’taffecttheexpressionofincreasedCyclinD1，EandCDK2，4werestimulatedbyPDGF；ButitcouldregulatethetranscriptionofmRNA，increasetheexpressionofp27protein；3)rapamycindosedependentinhibitedphosphorylationofP70S6K，thestrongestinhibitoryeffectappearedin1000nmol／Lgroup；rapamycinwerenosignificantimpactonphosphorylationofAKTandERKl／2in10nmol／L、100nmol／Lgroups，p-AKT、p-ERKproteinexpressionquantityslightlyhigherin1000nmol／Lgroup．ConclusionsRapamycinthroughmTORC1／P70S6KpasswayregulatedmRNAtranscription，increasedtheexpressionofp27protein，therebyinhibitedtheactivityofVI 万方数据山西医科大学博士学位论文cyclinE-CDK2，blockthecellcyclebyGO-G1phasetoSphase，inhibitedcellproliferation．Inratmesangialcells，largedoseofrapamycin(1000nmol／L)maybefeedbackactivatethepasswayofAKTandRas／Raf／ERK,thusweakenedtheinhibitioneffectofrapamycinoncellproliferation．Keywords：rapamycin，mTOR,IgAnephropathyrat，ratmesangialcellVⅡ 万方数据山西医科大学博士学位论文缩略词ALBK嘎ASTBGGBrdUBSABUNCDKCKIDAPIDEPCDMSOECMELISAESRDFBSFCMFITCFKBP．12hHRPIgANIgGIL．6英文全文Albumin英文缩略表AlanineanlinotransferaseAspartateaminotransferasebovinegamma-globulin5一bromo-2-deoxyuridinealbuminfromboVineserumbloodureanitrogencyclin—dependentkinasecyclin-dependentkinaseinhibitor4’，6一diamidino-2-phenylindolediethylpyrocarbonatedimethylsulphoxideextracellularmatrixEnzyme·linkedimmunoadsorbentassayEnd-stagerenaldiseasefetalbovineserumflowcytometeryFluorescinisothiocyateFKbindingproteins12hourhorseradishperoxidaseIgAnephropathyImmunoglobulinGInterleukin6VⅢ中文全文白蛋白谷丙转氨酶谷草转氨酶小牛血清球蛋白5．溴．2．脱氧核苷牛血清白蛋白血尿素氮周期素依赖性蛋白激酶周期蛋白依赖性激酶抑制因子4’，6．二脒基．2．苯基吲哚二乙基焦磷酰胺二甲基亚砜细胞外基质酶联免疫吸附试验终末期肾病胎牛血清流式细胞仪异硫氰酸荧光素FK结合蛋白．12小时辣根过氧化物酶IgA肾病免疫球蛋白G白介素．6 万方数据山西医科大学博士学位论文IL．8LPSMCmlnmRNAmTORODPBSPCRPDGF．BRAPASCrSDSSEBTBSTTEM匣DTGF—plTNF．0【TPVEGFQ．SMAInterleukin8LipopolysaccharideMesangialcellminuteMessengerribonucleicacidMamaliantargetofrapamycinOpticaldensityPhosphateBufferedSalinePolymeraseChainReactionPlateletderivedgrowthfactorRapamycinSerumcreatininesodiumdodecylsulfatestaphylococcalenterotoxinBTris．bufferedsalinetween．20TristetramethylethylenediamineTransforminggrowthfactor-beta1TumornecrosisfactoraTotalproteinVascularendothelialgrowthfactor理．SmoothmuscleactinIX白介素．8脂多糖系膜细胞分钟信使RNA哺乳动物雷帕霉索靶蛋白光密度磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应血小板衍生生长因子雷帕霉素血清肌酐十二烷基硫酸钠葡萄球菌肠毒素盐．吐温缓冲液四甲基二乙胺转化生长因子．p1肿瘤坏死因子0【血清总蛋白血管内皮生长因子平滑肌肌动蛋白0c 万方数据山西医科大学媳士学位论文刖吾IgA肾病(IgAnephropathy，IgAN)是以出现镜下血尿或肉眼血尿或蛋白尿、血清IgA水平升高、。肾脏病理显示肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积，导致系膜细胞增殖和细胞外基质沉积为特征的一类肾小球肾炎。目前认为IgA肾病在世界各地都是原发性肾小球肾炎中最常见的类型，在我国约占所有原发性肾小球疾病的26％"-34％，研究发现，在确诊后5"-'25年内，约20％"-40％的患者不可逆地进展为终末期肾病(end-stagerenaldisease，ESRD)u捌。IgAN的病因不清，发病机制与多种因素有关【31，如感染、免疫反应、炎症介质、遗传等。目前比较一致的看法是IgAN为一免疫复合物引起的肾小球疾病，有多种免疫机制参与了IgAN的发生。IgAN患者中IgAl增多，且缺乏半乳糖残基，结构异常的IgAl可以逃避肝细胞及单核细胞的吞噬，并导致IgAl·IC沉积于系膜区，IgAl能与系膜细胞及中性粒细胞上IgAl受体结合，从而刺激系膜细胞与中性粒细胞的增殖，并生成释放多种细胞因子，细胞因子可以再促进细胞的增殖与聚集，同时导致间质的纤维化【4】。国际上对leAN的治疗策略主要有以下几方面【5]：减少IgA免疫复合物的合成：限制IgA免疫复合物在系膜区的积聚；拮抗血小板源性生长因子和转化因子的作用，减轻系膜区的增殖和肾小球硬化：减少浸润的中性粒细胞对肾小球的损害作用。所以免疫抑制剂在治疗IgAN方面应具有广阔的前景。雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)是从吸水性链霉菌发酵液中提取出来的一种低毒性大环内酯类抗生素，是安全有效低毒的新型免疫抑制剂，为mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)抑制剂。mTOR是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(PIKK)，mTOR在细胞增殖、分化、转移和存活中具有重要地位161。在细胞受到刺激时而产生增殖、分裂的信号，信号通过也．2受体或生长因子受体激活磷酯酰肌醇3激酶(P13K)链，导致蛋白激酶B(PKB)活化。PKB直接激活mTOR，mTOR可调节至少三种在翻译过程中起重要作用的蛋白： 万方数据山西医科大学博士学位论文4E．BPl、p7056K(702KUS6激酶)和真核细胞翻译起始因子4GI(elF4GI)[7】，从而使细胞生长、增殖。雷帕霉素受体为FK结合蛋白(FKbmdmgproteins，FKBP一12)，雷帕霉素与相应的FKBP．12结合形成复合体，通过与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mamaliantargetofrapamycin，mTOR)结合导致mTOR失活，阻碍其下游信号转导通路：p70S6蛋白激酶被抑制，限制核糖体蛋白S6磷酸化及增殖细胞核抗原基因的转录；降低4E．BPl磷酸化，mRNA翻译起始过程受阻[S】；抑制p27介导CDK2．cyclinE的激活和DNA合成，上调细胞周期依赖性激酶抑制剂(p27bPl)，抑制细胞周期的演变f9J，阻止细胞由G1期至S期的进展，使细胞发育停滞在G1期。1999美国食品药品管理局批准雷帕霉素作为移植的抗排斥药物应用于临床。在上世纪90年代中期，由于雷帕霉素对T淋巴细胞增殖的抑制又引导人们将其用于抗肿瘤细胞治疗，并发现其同样具有较好的抗肿瘤活性[101。现在，医学界尝试将RAPA应用与肾病的治疗中并取得了惊喜的成果。Ramos．Barron等【11]报道腓可减轻【(NZBxW)FIId,鼠(狼疮性肾炎动物模型)的肾脏损害，减轻蛋白尿，改善肾功能，延长动物生存时间。Sakaguchi等【l2】在STZ诱导的早期糖尿病小鼠上发现RAPA不仅抑制了p70S6激酶的磷酸化，而且还可以下调p21和p27的表达，从而抑制了糖尿病小鼠的近端肾小管上皮的肥大。Lloberasdetl3]认为，RAPA可以显著抑制肾脏内mTOR通路下游基因表达，延缓糖尿病肾病的进展。Rangan等【14]在雄性成年Wistar大鼠注射阿霉素建立非免疫性的FSGS(局灶阶段性肾小球硬化)模型。并给与RADA治疗，验证了RAPA能降低肾肥大和小管上皮细胞增生，延缓肾衰进程，减少肾小球毛细血管簇扩张，防止间质纤维化。膜性肾病是导致人。肾病综合征的常见原因之一，在其主动型和被动型Heymarm肾炎两种模型[15，16】中均发现，RAPA能改善肾功能，降低蛋白尿，缓解。肾小管间质浸润和间质纤维化进展。同时KrOner【17】等人研究结果显示，在系膜增生性大鼠模型(anti-thyl肾小球肾炎)，雷帕霉素能显著减轻肾小球肾炎的各种症状；Locketa1．【18】也同时发现，低剂量的雷帕霉2 万方数据山西医科大学博士学位论文素能明显抑制系膜细胞的增殖。雷帕霉素强大的抗炎、抗增殖、抗纤维化效应，将在防治肾病中发挥重要的作用。IgA肾病09Anephropathy，IgAN)是以肾脏病理显示肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积，导致系膜细胞增殖和细胞外基质沉积为特征的一类肾小球肾炎。所以我们推测，雷帕霉素也应该能用于治疗和预防IgA肾病。目前尚没有关于雷帕霉素在IgA肾病中作用的相关研究。那么，在IgA肾病的发生与发展中，mTOR发挥怎样的作用?阻断mTOR通路传导是否能抑制IgA肾病的进展?mTOR又激活了下游的哪些分子，产生哪些细胞因子，它们和IgA肾病又有什么样的关系?在肿瘤细胞中发现的耐药现象与反馈性激活Akt通路有关，那么在肾小球系膜细胞中，使用雷帕霉素是否也会出现这一现象呢?本课题旨在研究雷帕霉素在IgA肾病大鼠模型中的作用及靶向干预机制，同时探讨细胞周期蛋白，触汀／mTORCl与系膜细胞增殖的关系。本研究首先建立IgA肾病大鼠模型，给予雷帕霉素，观察其对大鼠肾功能的影响；然后检测肾组织细胞因子、生长因子、纤维化因子，明确其作用机制；通过检测P13刚AKT／mTOR信号通路蛋白的表达，探讨IgA肾病的发病机制；其次，我们培养大鼠系膜细胞，研究雷帕霉素抑制系膜细胞增殖的机制，同时探讨雷帕霉素对相关信号传导通路P13ⅪAKT／mTORCl及MAPK／ERKI／2的作用。 万方数据山西医科大学博士学位论文参考文献：[1]．FloegeJ．Evidence-basedrecommendationsforimmunosuppressioninIgAnephropathy：handlewithcaution．NephrolDialTransplant，2003，18：241-245，．[2】．JulianBA，NovakJ．IgAnephropathy：anupdate．CurrOpinNephrolHypertens，2004，13：171—179．[3】．WadaJ，SugiyamaH，MakinoH．PathogenesisofIgAnephropathy,2003，23(6)：556—63．【4]．SegarraA．ProgressinunderstandingthepathogenesisofIgAnephropathy：Newperspectivesforthenearfuture?Nefrologia，2010，30(5)：501-7．[5]．LaiKN．FuturedirectionsinthetreatmentoflgAnephropathy[J]．Nephron，2002，92(2)：263-270．[6】．Brunskill，N⋯JRapamycin：anewstr吨totheantiproteinuricbow?JAmSocNephrol，2005，16(7)：1878-9．[7】．SarbassovDD，AliSM，SabatiniDM．GrowingrolesforthemTORpathway．CurrOpinCellBiol，2005，17：596-603．【8]．HayN，SonenbergN．Upstreamanddown-streamofmTOR．GenesDev,2004，18：1926_1945．[9】．SchmelzleT，HallMN．mTOR,acentralcontrollerofcellgrowth．Cell，2000，103(2)：253—262．[10]．HuangS，HoughtonPJ．Inhibitorsofmammaliantargetofrapamycin．novelantitumoragents：Frombenchtoclinic。CuaOpinInvestDrugs，2002，3：295．304。[11]．Ramos—BarronA，Pinera-HacesC，Gomez-AlamilloC，Santiuste．TorcidaI，RuizJC，Bueka·CarrilloL，MerinoRdeFranciscoAL，AriasM。Preventionofmurinelupusdiseasein(NZBxNZW)F1micebysirolimustreatment．Lupus，2007，16(10)：775-781．[12]．SakaguchiM，IsonoM，IsshikiKSugimotoT，KoyaD，KashiwagiA．Inhibition4 万方数据山西医科大学博士学位论文ofmTORsignalingwithrapamycinattenuatesrenalhypertrophyintheearlydiabeticmice．BiochemBiophysResCommun，2006，340(1)：296．301．【131．Lloberas，N，Cruzado，JM，Franquesa，M，Herrero．Fresneda，I，Torras，J，Alperovich，GRama,I，Vidal，A&Grinyo，JM．Mammaliantargetofraparnycinpathwayblockadeslowsprogressionofdiabetickidneydiseaseinrats．JAmSocNephrol，2006，17：1395—404．．【14]．RanganGK，CoombesJD．Renoprotectiveeffectsofsirolimusinnon．immuneinitiatedfocalsegmentalglomerulosclerosis．NephrolDialTransplant，2007，22(8)：2175-2182．[15]．NaumovicR，JovovicD，BasraJGMiloradovicZ，MihailovicSN，AleksicT，JovanovicD．EffectsofrapamycinonactiveHeymannnephritis．AmJNephrol，2007，27(4)：379—389．[16]．BonegioRCS，Fuhro凡WangZ，ValeriCR，AndryC，SalantDJ，LieberthalW．Rapamycinamelioratesproteinuria-associatedtubulointerstitialinflammationandfibrosisinexperimentalmembranousnephropathy．JAmSocNephr01．2005，16(7)：2063—2072．[171．Kramcr,S，Wang—RoscOe，YScholl，V，Binder，E，Loof,T，Khadzhynov，D，Kawachi，H，Shimizu，F，Diekmann，F，Budde，KNeumayer,HH&Peters，H。Low-dosemTORinhibitionbyrapamycinattenuatesprogressioninanti—thyl-inducedchronicglomerulosclerosisoftherat。AmJPhysiolRenalPhysiol，2008，294(2)：F440-9．[18]．Lock，H．R．，S．H．SacksandM．GRobson，Rapamycinatsubimmunosuppressivelevelsinhibitsmesangialcellproliferationandextracellularmatrixproduction．AmJPhysiolRenalPhysiol，2007，292(1)：F76-81．5 万方数据山西医科大学博士学位论文第一部分雷帕霉素治疗IgA肾病大鼠疗效观察及机制研究IgAN的病因不清，发病机制与多种因素有关，如感染、免疫反应、炎症介质、遗传等。目前比较一致的看法是IgAN为一免疫复合物引起的肾小球疾病，有多种免疫机制参与了IgAN的发生。IgAN患者中IgAl增多，且缺乏半乳糖残基，结构异常的IgAl可以逃避肝细胞及单核细胞的吞噬，并导致IgAl一IC沉积于系膜区，IgAl能与系膜细胞及中性粒细胞上IgAl受体结合，从而刺激系膜细胞与中性粒细胞的增殖，并生成释放多种细胞因子，细胞因子可以再促进细胞的增殖与聚集，最终导致间质的纤维化。因此，本研究通过建立IgAN大鼠模型，观察雷帕霉素作为一种新型的免疫抑制剂，是否能干预IgAN进展的多个环节从而对IgAN的起到一定的治疗作用。本部分实验分为三个内容：(一)建立IgAN的大鼠模型，观察雷帕霉素对其各项生理生化功能参数的影响；(二)雷帕霉素保护作用及相关机制的研究，主要干预了哪些I∥N进展的环节；(三)，雷帕霉素为mTORCl(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)抑制剂，大量的研究证明，肾脏疾病的发生发展与P13Ⅺ他t／mTORCl通路有着密切的关联，在IgAN的大鼠模型中Akt／mTORC1这条信号通路是否异常激活。6 万方数据山西医科大学博士学位论文实验一雷帕霉素对IgA肾病大鼠体重、24小时尿蛋白及肝肾功能的影响首先我们建立IgA肾病大鼠模型，并对模型进行鉴定后，分组给予药物干预，药物剂量是通过参考文献及预实验筛选，观察药物会对大鼠的各项功能参数产生怎样影响，明确雷帕霉素对lea肾病的治疗作用，同时观察其可能产生的副作用，是否会影响大鼠的生长发育，肝功能等。材料与方法1、实验材料1．1动物健康清洁级6周龄Wistar雄性大鼠52只(山西医科大学动物实验中心)，体重约150萨10g，适应性喂养l周，所有大鼠均行动活跃、毛发光泽，两次尿蛋白定性试验阴性(试纸条法)。在整个实验过程中，所有大鼠均自由食用动物实验中心提供的标准饲料和自来水。1．2主要仪器微量加样器德国Eppendorf公司SW-CJ．2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司BS210S型Sartorius电子天平北京赛多利斯天平有限公司MDF．U32V低温冰箱日本SANYO公司．70冰箱中国海尔公司电热恒温水浴箱上海伊欧斯实业有限公司SHAC电热恒温水槽常州国华电器公司YXOG02型手提式电热压力蒸汽消毒锅山东安得医疗科技有限公司超纯水设备美国Millipore公司202．0型台式干燥箱北京市永光明医疗仪器厂微型振荡器北京金北德工贸公司 万方数据山西医科大学博士学位论文TGL．16B高速台式离心机BRl6型高速冷冻离心机721分光光度仪UnicelDxC800型自动生化分析仪病理切片机冰冻切片机光学显微镜pm20显微镜自动曝光系统激光共聚焦显微镜1．3主要试剂牛血清白蛋白(BSA)蓖麻油四氯化碳脂多糖(LPS)水合氯醛二甲基亚砜(DMSO)雷帕霉素丽春红荧光素标记羊抗大鼠IgA抗体抗荧光衰减封片剂其余试剂均为市售分析纯1．4试剂配置雷帕霉素10％水合氯醛上海安亭科学仪器厂安新县白洋离心机厂上海第三分析仪器厂美国Beckman公司美国Leiea公司美国Leica公司日本OLYMPUS公司北京Solarbio公司天津市光复精细化工试剂有限公司美国Sigma公司天津市光复精细化工试剂有限公司美国Sigma公司瑞士Adamas．beta公司上海生物工程有限公司美国Abcam公司武汉博士德生物配置0．15mg／ml浓度的雷帕霉素，以1mg／kg·d给药，3009大鼠给药2ml水合氯醛109去离子水100ml 万方数据山西医科大学博士学位论文10％中性福尔马林PBS平衡盐溶液避光保存甲醛磷酸二氢钠磷酸氢二钠蒸馏水NaClKClNa2HP04·12H20l加0．2mol／L氢氧化钠(NaOH)2ml，混合使沉淀溶解，用560波长测吸光值，查标准曲线换算尿蛋白含量。2．4．2全自动生化分析仪检测生化指标采用DxC800型自动生化分析仪检测血肌酐(Ser)、尿素氮(BUN)、血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。 万方数据山西医科大学博士学位论文2．4．3冰冻切片免疫荧光观测IgA沉积>新鲜肾组织OCT包埋，冰冻切片4um，丙酮固定lO分钟，室温干燥；>PBS洗3次，室温下微干，滴加FITC标记的兔抗鼠IgA抗体(1：100)，4。C暗盒过夜；>PBS洗三次，室温晾干封片，共聚焦显微镜下观察，摄影。2．4．4肾组织形态学分析(1)10％中性福尔马林固定肾组织24小时以上，组织经酒精脱水、二甲苯透化、浸蜡、石蜡包埋，切片，60"C烤箱2小时之后备用。(23HE(苏木素．伊红)染色：>石蜡切片，二甲苯I、II、IⅡ脱蜡，各15分钟；100％、95％酒精，各5分钟后，放入蒸馏水中；》苏木素染色6分钟，水冲洗；》1％盐酸分化20秒，水冲洗：>1％氨水返蓝30秒，水冲洗；>伊红染色20秒至5分钟，水冲洗；>85％酒精20秒_◆90％30秒-◆95％1分钟_◆100％酒精2分钟；>二甲苯I、II、III各2分钟，中性树胶封片。(3)PAS(过碘酸雪夫)染色：>二甲苯脱蜡完毕，水冲洗；>1％过碘酸10分钟，水冲洗；>滴加Sch游试剂，避光15分钟，水冲洗；>HE染色>酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片(4)Masson染色：>二甲苯脱蜡完毕，水冲洗；>0．5％天青石兰浸泡5-6分钟，水冲洗： 万方数据山西医科大学博士学位论文>苏木素染色5分钟，水冲洗；>1％丽春红：2％酸性品红(1：2)15分钟；>1％磷铝酸(分化)，过一下；>0．5％冰醋酸，过一下；>1％光绿，3分钟；1％磷钼酸，0．5％冰醋酸过一下；>酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片显微镜下观察结果，摄影，分析2．5统计学分析采用SPSS10．0软件包进行统计学处理，所有数据均以i±S标准差表示。各组间资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，检验水准为a=O．05。 万方数据山西医科大学博士学位论文结里拿日刁≮1、IgA肾病大鼠动物模型的建立1．1lgA免疫荧光沉积正常对照组在第6周及12周末大鼠肾组织均未见明显的IgA沉积，荧光强度一～士；IgA肾病大鼠第6周末系膜区开始出现颗粒状的IgA沉积，荧光强度为卅，l2周末IgA沉积显著，呈连续性片状沉积，荧光强度达到卅～++++。6week12weekControIIsAN图1．1一l系膜区IgA荧光沉积强度(共聚焦显微镜，×200)1．2HE、PAS和Masson染色显示系膜细胞增生和系膜基质的沉积光镜下对照组大鼠肾组织结构正常；肾病模型组大鼠病理改变在第6周末开始出现，系膜细胞开始增生，但表现尚不显著；12周末，可见。肾小球出现肿胀，体积增大，主要表现为系膜区细胞及基质的增生，与临床常见IgAN光镜下病理改变一致。 万方数据HEhr■一一4审，≥．k。．．．～，≈、‘．熊，垂嚣7，一’Y乞t，一i：．|■羚。舔0一一：：’≮0二：参?0。l：。、。：．碍!12week·誓≤0一～。，0一二芝o，誊鬻：。五岁1’文!．：0PAS6week12week图1．1—2对照组与模型组在6w、12w肾小球HE、PAS及MASSON特异染色(光镜，×400)一oJ-LlouZ<旦 万方数据山西医科大学博士学位论文1．312周末IgA肾病大鼠生化指标未见明显改变造模12周末，模型组大鼠Scr、BUN、TP、ALB、』蝴、AST各项生化指标分别与对照组比较，差异无统计学意义(胗O．05)。表1．1．1对照组与模型组大鼠12周末生化指标(元士s)：里旦堕2119叁丛Serumcreatinine(I-maol／L)32．15"-6．6134．50"-6．07Ureanitrogen(mmoVL)5．31士1．266．05+1．78Totalprotein(n)55．58"-7．0552．73"-5．04Albumin(g／L)14．04"-1．6512．78"-2．48Alanineaminotransferase(U／L)36．88"-6．0832．00-J：5．42以上结果表明IgA肾病大鼠模型制备成功。2、雷帕霉素对肾病大鼠体重、蛋白尿的作用2．1实验对大鼠体重影响实验前大鼠平均体重为1509士109，实验过程中对照组与模型组第1周生长最快，平均509左右，第2周到第5周平均在20-259，第6周后体重增长较前稍慢，平均每周增长13～169。模型组大鼠在第6周尾静脉注射LPS后出现精神萎靡，食欲不振、鼠毛蓬乱，约l周后缓解，对体重影响不大。12周后加用RAPA干预，各组体重均未出现明显差异(胗0．05)。表1．1—2不同时间各组大鼠体重的增长(i4-s，g) 万方数据山西医科大学博士学位论文6005006400C西霎3002001006周9周12周16周time(weeks)图1．I．3各组大鼠体重增长情况(2士s，g)2．2雷帕霉素明显减少24h尿蛋白量造模前各组大鼠蛋白尿定性阴性，在造模第4周末开始出现少量的尿蛋白，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0．05)；此后，模型组尿蛋白持续升高，12周末达到19．38：t：4．25mg／24h；与对照组比较有显著差异(P<0．01)；16周末，未治疗组蛋白尿仍继续增长至32．61士6．46mg／24h，而RAPA干预治疗4周后，模型组的尿蛋白由22．00士3．98mg／24h降低至15．52：1：2．76mg／24h，但仍高于对照组的4．22士0．33mg／24h，差异均有统计学意义(尸0．05)；与对照组比较IgAN组在16周末Scr略微升高，差异有统计学意义(p<0．05)，而雷帕霉素干预组，Scr则为正常值，与对照组比较无明显差异(p>0．05)。∞们∞一c寸巡西E一∞c：c一∞_I—D‘乱 万方数据山西医科大学博士学位论文表1．1-4各组生化指标(夏士s)注：与对照组相比，木P处死大鼠前24小时，腹腔注射BrdUO．5ml／1009；>取新鲜肾组织OCT包埋，冰冻切片4um，丙酮固定10分钟，室温干燥，PBS洗5分钟3次：>2NHCL37℃30分钟，PBS冲洗5分钟，3次；>1：20正常山羊血清封闭30分钟，甩去多余的液体不洗； 万方数据山西医科大学博士学位论文>抗BrdU一抗(1：200)，4。C湿盒过夜，PBS冲洗5分钟，3次；>an--抗，FITC标记山羊抗小鼠(1：200)，37度避光2小时，PBS冲洗5分钟，3次>DAPI复染5分钟，PBS冲洗；>50％甘油封片，共聚焦显微镜下观察，拍片。2．4．3ABC免疫组化法检测肾皮质TGF．pl、PDGF．B、0【-SMA、CollagensI和llI的蛋白表达>10％中性福尔马林固定肾组织24小时以上，组织经酒精脱水、二甲苯透化、浸蜡、石蜡包埋，切片，60℃烤箱2小时之后备用。>切片脱蜡，水冲洗2遍，PBS洗3次；>3％H202室温孵育10分钟，灭活组织中内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗3次，PBS液冲洗3次；>置于PH6．0柠檬酸修复液中，高压抗原修复2分钟，室温冷却，PBS冲洗3次；>加山羊血清37℃封闭30分钟，甩去多余液体，>加一抗，TGF-151、PDGF-B、a-SMA、CollagensI和III抗体(1：100稀释，37。C孵育2小时4。C湿盒过夜，PBS冲洗3次；>加生物素标记二抗，37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次；>加AB酶试剂，37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次；>DAB显色，30秒至10分钟，显微镜下观察显色情况；>弃去多余DAB，放入水中终止反应；>苏木素复染，盐酸分化后，脱水透明，中性树胶封片观察。采用Image．ProPlus图像分析系统对免疫组化结果进行半定量分析，每份标本检测10个高倍视野，以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性结果，平均光密度(IODSUM／area)表示阳性物质的相对含量，以PBS代替一抗作阴性对照。 万方数据山西医科大学博士学位论文2．4．4Real-timePCR检测上述指标mRNA的表达量(1)肾组织总RNA提取⋯采用Trizol抽提总RNA>称取冻存的大鼠肾皮100mg，快速置于预冷的研磨碗内研磨，边研磨边加入液氮；>研磨成粉状后加入Trizol试剂lml，继续研磨使其裂解完全；>用Iml注射器反复抽吸后，放入1．5mlEP管中，2000rpm，4。C离心10分钟；>取上清，加入0．2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min：>12000rpm，40C离心15min，离心后混合物分离为三层：包含RNA的无色上清液，中间白色酚．氯仿相，底层为浅红色有机相；>小心吸取上层水相(200．300u1)到另一新的1．5ml离心管中，不要吸取任何中间层物质；>加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min；>12000rpm，4"C离心10min，一般在离心后，管底会出现沉淀，即为RNA；>小心弃去上清，缓慢沿管壁加入75％乙醇洗涤RNA沉淀，12000rpm，4。C离心5min，小心弃去乙醇；>室温干燥2．5分钟，用适量的DEPCH20溶解RNA：>RNA的分析和定量：测定样品在260hm和280nm的吸光度值，rnRNA浓度(g／L)=OD260x核酸稀释倍数x40／1000计算mRNA浓度(或按10D260=401xg计算RNA产率)；OD260／280在1．8—2．0视为RNA纯度理想；>mRNA完整性的鉴定：进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察28S、18S、5S条带的宽度和亮度，以判断RNA有无降解。(2)RNA逆转录①反应体系 万方数据山西医科大学博士学位论文5xPrimeScriptBuffer2“lTotalRNA(500ng)‘Xp．1RNasefreeH208-Xlal总体积10ul事实验样品RNA体积根据RNA浓度进行计算，10I．tl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。②反转录反应条件如下：37℃15min85℃5s4℃forever(3)PCR引物设计根据GeneBank中大鼠的Pdgfb、Tgfbl、Acta2(a-SMA)、Collal、Col3al的cDNA序列和PCR引物设计原则，请TaKaRa公司进行引物设计，用计算机引物设计软件‘'PremierPrimer5”进行评价。表1．2．1引物序列GenePrimerSequences(5’to3’)Length(bp)Pd2fbforwardCTGAGGATGCCTTGGAGACAAAC129reverseTCTTGCAAACTGCGGGAATGTgfblforwardCATTGCTGTCCCGTGCAGA103reverseAGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTAActa2(a-SMA1forwardAGCCAGTCGCCATCAGGAAC127reverseGGGAGCATCATCACCAGCAACol3alforwardrrTGGCACAGCAGTC(、AATGTA12lreverseGACAGATCCCGAGTCGCAGACollalforwardGACATGTTCAGCTlTGTGGACCTC119reverseGGGACCCrL～GGCCAlTGTGTAGapdhforwardTGAACGGGAAGCTCACTGG134reverseTCCACCACCCTGTTGCTGTA27 万方数据山西医科大学博士学位论文(4)ReakimePCR及定量方法①反应体系2xSYBRGreenIPCRBuffer12．59lRNasefreeH208．59l上游特异性引物(100M)lid下游特异性引物(109M)lgleDNA29l总体积259l②反应条件95℃10min95℃15s'、60℃30s．J40}个循环绘制扩增曲线及溶解曲线③结果分析：反应结束后，通过产物的溶解曲线判定引物的特异性。利用比较Ct法检测各样本mRNA的表达情况，倍增变化率-2出Q。其cPact为目的基因和内参照基因Ct值的差值，AACt=目的基因△Ct一对照基因△Ct。2．5统计学分析采用SPSSl0．0软件包进行统计学处理，所有数据均以冤±s标准差表示。各组间资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，检验水准为a=0．05。 万方数据山西医科大学博士学位论文馇里=日7尺1、雷帕霉素减少肾小球IgA的沉积16周末我们可以观察到IgAN组系膜区可见大量荧光沉积，提示IgA。肾病病情持续进展，而加用RAPA干预后，荧光沉积明显减少，说明雷帕霉素可以有效抑制IgA在肾小球的沉积。vehicleRapao扫口oZ《∞■-■图1．2．1药物干预4周后肾小球系膜区IgA荧光沉积(共聚焦显微镜，×200)2、雷帕霉素抑制肾小球系膜细胞增殖我们用BrdU方法检测雷帕霉素对IgA肾病大鼠系膜细胞的抑制作用。细胞增殖标记物BrdU(5．溴．2．脱氧核苷)，是胸腺嘧啶的衍生物，在DNA合成期(S期)可代替胸腺嘧啶，活体注射后，利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞，同时用DAPl(4’，6．二脒基．2．苯基吲哚)染细胞核，观察增殖现象。正常对照组细胞增殖为5士1，IgAN组可见系膜细胞的大量增殖，而用腓T预后，明显抑制细胞的增殖(18士4VS8士3，P<0．01)，但较正常对照+RAPA 万方数据山西医科大学博士学位论文组仍较高(8+3VS4-4-1，P<0．05)。弓暑8日譬配土0皇C0oBrduDAPIMergeZ《嚣I碍口对国+Z茜H 万方数据山西医科大学博士学位论文controlcontrol+RapaIgANIgAN+Rapa1．2-2BrdU检测显示雷帕霉素抑制IgA。||子病大鼠系膜细胞增殖(共聚焦显微镜，x200)注：与对照组相比，}P<0．05料P<0．01；与IgAN组相比，撑拌P<0．013、雷帕霉素下调lgA肾病大鼠间质纤维化因子TGF．pl、PDGF-B的表达系膜细胞增殖后，会释放一系列细胞因子，TGF．Dl、PDGF．B是重要的纤维化因子，可促进细胞外基质的释放。我们的结果显示，IgAN组可见到TGF．Dl、PDGF．B表达较对照组明显增高(尸<0．01)，IgAN+Rapa组较IgAN组的表达显著减少(P0．05)(图1．2—6B)。 万方数据 万方数据山西医科大学博士学位论文为了进一步确定，我们提取了肾皮质mRNA，通过real．timePCR分析了OL—SMA、collagensI和IIImRNA的表达量。结果显示，0【一SMA及collagensIII与组化结果相一致，雷帕霉素有效的减少了二者mRNA的表达量：但出乎意料的是，我们发现IgAN组collagensImRNA较正常对照组有明显的增多(P<0．05)，IgAN+Rapa组则可降低collagensImRNA的表达量(尸．<0．05)表1．2．3各组肾皮质mRNA的表达(元士s)注：与对照组相比，·P<0．05事+尸<0．01；与IgAN组相比，‘拌P<0．05槲P<0．0图1．2．7各组肾皮质mRNA的表达(i士s)注：与对照组相比，堆P<0．05料P<0．01；与IgAN组相比，}}P<0．05蝌P<0．01∞IJu>u一《Z2_LIu^I-旦ug 万方数据山西医科大学博士学位论文讨论IgAN的病因不清，发病机制与多种因素有关‘川，如感染、免疫反应、炎症介质、遗传等。目前比较一致的看法是IgAN为一免疫复合物引起的肾小球疾病，有多种免疫机制参与了IgAN的发生。IgAN患者中lgAl增多，且缺乏半乳糖残基，结构异常的IgAl可以逃避肝细胞及单核细胞的吞噬，并导致IgAl-IC沉积于系膜区，lgAl能与系膜细胞及中性粒细胞上IgAl受体结合，从而刺激系膜细胞与中性粒细胞的增殖，并生成释放多种细胞因子，细胞因子可以再促进细胞的增殖与聚集，同时导致问质的纤维化‘12】。口0半乳膏链缺失。^△_。_1结构异书Ig^lJtIl^lp广、、d间质纤维化IgA肾病发病机制(免疫学说)IgA肾病典型的病理改变特点是IgAl的沉积，系膜细胞增生和系膜基质扩张【l31。在大多数IgA肾病患者，存在循环水平半乳糖链缺失型IgAl的升高，这是一个诱发因素但不足以引起肾病，要产生。肾脏疾病，半乳糖链缺失型IgAl必须沉积在。肾小球系膜区。所以IgA沉积在肾小球系膜是IgAN发展至关重要的一步【121。低剂量的雷帕霉素减少IgA。肾小球系膜区的沉积；我们用雷帕霉素治疗4周后，lgA的荧光强度并没有增加，说明雷帕霉素可以抑制IgAl在系膜区的沉积；但同时我们也发现，治疗组较对照组lgA沉积仍较显著，这一结果提示，雷帕霉素并不减少用药前已经沉积的IgA，所以如何能更彻底的减少沉积是我们／7／． 万方数据山西医科大学博士学位论文需要继续关注的问题。在进行性肾小球损伤中，首先出现的系膜细胞的生理学变化，系膜细胞的大量增殖可导致细胞外基质的成分改变继而引起肾小球的硬化【l41。雷帕霉素非常显著的一个作用就是抑制细胞的增殖。在以前的大量研究中，我们可以发现，雷帕霉素不但抑制淋巴细胞的增殖，同时可以抑制抑制平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞等的增殖[15-17】。Locketa1．[181也同时发现，低剂量的雷帕霉素能明显抑制系膜细胞的增殖。在我们实验中，用BrdU染色来检测细胞增殖的情况，结果我们发现，雷帕霉素能显著抑制系膜细胞的增殖。在系膜增生性大鼠模型中，也发现了同样的结果【9】。a．SMA为平滑肌肌动蛋白，正常肾组织只在血管壁有表达。在IgA肾病当系膜细胞激活时，生长因子会诱导a．SMA的表达，所以a．SMA为系膜细胞激活的标志。系膜细胞激活会导致大量细胞外基质(ECM)I蝴积【l01，从而引起肾小球的纤维化。ECM包括正常成分0v型胶原、层粘连蛋白和蛋白聚糖)以及异常成分(I和III型胶原蛋白)¨91。因此，在我们实验中主要研究了仅．SMA和胶原蛋白I和III型的表达。结果显示，低剂量的雷帕霉素显著抑制0【．SMA及胶原蛋白III的表达，且mRNA表达量也下降，说明雷帕霉素通过调控mRNA的转录而减少0L．SMA及胶原蛋白III翻译生成。令我们吃惊的是，组化结果显示胶原蛋白I在IgAN组并没有明显的表达，但在mRNA的检测中则发现较对照组其表达量有所增高，而雷帕霉素组抑制了mRNA生成。这一现象说明，胶原蛋白I升高的时间较III要晚，在16周末，胶原蛋白I的mRNA已经增加，随后会转录生成胶原蛋白I，所以不排除这种可能性，随着疾病的进展胶原蛋白I表达量会逐步增多；而我们在早期使用雷帕霉素干预，则可阻止胶原蛋白I的生成与沉积。在实验中我们还分析了特定生长因子在IgAN发挥的致病作用。PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，PDGF—BB型式能促进纤维母细胞的生K，并促进肌纤维母细胞产生胶原，尤其是I型及III型胶原。TGF．p1是属于‘组新近发现的训节细胞生长和分化的TGF—p超家族， 万方数据山西医科大学博士学位论文TGF一131抑制免疫活性细胞的增殖，抑制淋巴细胞的分化，抑制细胞因子产生，促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长，促进细胞外基质(ECM)如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制ECM的降解，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用。研究表明，TGF．131及PDGF表达增多与肾小球硬化密切相关[20-22】。在IgAN组，我们发现两者的表达均较对照组有显著的增加，而雷帕霉素降低肾小球PDGF和TGF．p1表达。肾小球系膜细胞刚C)、细胞因子和细胞外基质(ECM)之间的相互作用会影响IgA肾病的进展，三者可以互相促进，而雷帕霉素则可以抑制它们之间的相互作用，从而阻止IgA肾病的进展。这一部分的研究表明，雷帕霉素直接或间接干扰IgAN发展终末期肾病(ESRD)的多个关键环节：1)减少了IgA的沉积和抑制细胞增殖；2)减少IgA。肾病大鼠系膜细胞激活及细胞外基质的分泌；3)下调促纤维化生长因子PDGF和TGF．131的表达，从而减缓IgA肾病的进展为慢性肾功能衰竭。 万方数据山西医科大学博士学位论文实验三IgA肾病大鼠中mTORCl信号通路蛋白异常激活从前两部分实验中我们可以看出，雷帕霉素对IgAN似乎有明显的治疗作用，而雷帕霉素为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制剂，可以特异性阻断mTORCl信号传导途径，所以我们推断，mTORCl信号在IgA肾病的发展过程中起着非常重要的作用。本部分内容主要研究了mTORCl信号通路蛋白S6的表达情况，从而探讨mTORCl信号通路在IgA肾病中的作用。材料与方法1、实验材料1．1动物健康清洁级6周龄Wistar雄性大鼠52只(山西医科大学动物实验中心)，体重约150g士10g，适应性喂养1周，所有大鼠均行动活跃、毛发光泽，两次尿蛋白定性试验阴性(试纸条法)。整个实验过程中，所有大鼠均自由食用动物实验中心提供的标准饲料和自来水。1．2主要仪器微量加样器德国Eppendorf公司SW-CJ．2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司BS210S型Sartorius电子天平北京赛多利斯天平有限公司MDF．U32V低温冰箱日本SANYO公司．70冰箱中国海尔公司电热恒温水浴箱上海伊欧斯实业有限公司SHAC电热恒温水槽常州国华电器公司YXOG02型手提式电热压力蒸汽消毒锅山东安得医疗科技有限公司超纯水设备美国Millipore公司202．0型台式干燥箱北京市永光明医疗仪器厂微型振荡器北京金北德工贸公司TGL．16B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂 万方数据山西医科大学博士学位论文BRl6型高速冷冻离心机Ⅳ92．IID超声波细胞粉碎机病理切片机光学显微镜prn20显微镜自动曝光系统Image-ProPlus图像分析系统WellscanMK3酶标仪24D型迷你双垂直电泳仪DYCZ．40D型迷你转印电泳仪DYY．11型电脑三恒多用电泳仪电源WD．9465B型水平摇床QuantityOne分析系统1．3主要试剂雷帕霉素二甲基亚砜(DMS0)Tween-20甘氨酸Tris碱5×蛋白上样LoaddingBufferAcrylamide丙烯酰胺N’N’．亚甲基双丙烯酰胺Ammoniumpersulfate过硫酸铵TEMED脱脂奶粉彩色预染超高分子量蛋白质标准硝酸纤维素膜41安新县白洋离心机厂宁波海曙科生超声有限公司美国Leica公司日本OLYMPUS公司美国MediaCybernetics公司芬兰雷勃仪器厂北京市六一仪器厂美国BIO．RAD公司瑞士Adamas．beta公司美国Sigma公司北京Solarbio公司上海生工北京Solarbio公司美国BD公司武汉博士德生物 万方数据山西医科大学博士学位论文SuperSignal鑫．WestPico化学发光底物光胶片(5x7)显影粉、定影粉BCA蛋白浓度测定试剂盒全蛋白抽提试剂盒(KGP250)S6RibosomalProtein(5G10)RabbitmAbPhospho-S6RibosomalProtein(Ser235／236)(9182)RabbitmAb13-actinImmunoCruzTMrabbitABCStainingSystemgoatanti-rabbitIgG—HRP1．4试剂配置1．0MTris．HCL(PH7．5)Tris碱去离子水1．5MTris．HCL(PH8．8)0．5MT’ris．HCL(PH6．8)TBST10％SDS美国Pierce公司美国柯达天津双翼化工公司南京凯基生物科技发展有限公司美国CellSignalingTechnology美国CellSignalingTechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology30．299200ml浓盐酸调PH值至7．5，定容至250mlTris碱45．439去离子水200ml浓盐酸调PH值至8．8，定容至250mlTris碱15．149去离子水200ml浓盐酸调PH值至6．8，定容至250mlNacl8．891．0MTris．HCL20mlTween200．5ml去离子水定容于1LSDS10942 万方数据山西医科大学博士学位论文30％丙烯酰胺25％过硫酸铵(AP)电泳缓冲液转移缓冲液去离子水80ml加热至68。C溶解，浓盐酸调PH值至7．2，定容100ml丙烯酰胺299N'N一亚甲双丙烯酰胺19温热去离子水分别溶解后定容至100ml滤纸过滤，贮于棕色试剂瓶中，4。C，保存数月过硫酸铵0．259去离子水1．0ml4。C保存一周Tris-Base3．0289甘氨酸14．4910％SDS10ml去离子水定容于1LTris-Base5．89甘氨酸2．93910％SDS3．75ml甲醇200ml去离子水定容于1L5％BSA(或脱脂奶粉)封闭液BSA(或脱脂奶粉)59TBST缓冲液100ml现用现配2、实验方法2．1IgA肾病大鼠动物模型的建立、实验分组及药物干预及标本的采集同实验一2．2ABC免疫组化法检测肾皮质pS6蛋白表达>10％中性福尔马林固定肾组织24小时以上，组织经酒精脱水、二甲苯 万方数据山西医科大学博士学位论文透化、浸蜡、石蜡包埋，切片，60。C烤箱2小时之后备用。>切片脱蜡，水冲洗2遍，PBS洗3次；>3％H202室温孵育10分钟，灭活组织中内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗3次，PBS液冲洗3次；>置于PH6．0柠檬酸修复液中，高压抗原修复2分钟，室温冷却，PBS冲洗3次；>加山羊血清37。C封闭30分钟，甩去多余液体，>加一抗，pS6抗体37*C孵育2小时4。C湿盒过夜，PBS冲洗3次；>加生物素标记二抗，37℃孵育30分钟，PBS冲洗3次；>加AB酶试剂，37。C孵育30分钟，PBS冲洗3次；>DAB显色，30秒至10分钟，显微镜下观察显色情况；>弃去多余DAB，放入水中终止反应；>苏木素复染，盐酸分化后，脱水透明，中性树胶封片观察。采用Image·ProPlus图像分析系统对免疫组化结果进行半定量分析，每份标本检测10个高倍视野，以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性结果，平均光密度(IODSUM／area)表示阳性物质的相对含量，以PBS代替一抗作阴性对照。2．3蛋白提取及Westernblotting分析肾皮质S6、pS6蛋白表达2．2．1组织蛋白提取①凯基全蛋白提取试剂盒组份(50tests)LysisBuffer50ml磷酸酶抑制剂500I_tl蛋白酶抑制剂50I．tlPMSF(100mM)500“1②蛋白提取步骤>在每ml冷LysisBu行er力口入10“l磷酸酶抑制剂，lbtl蛋白酶抑制剂和10¨lPMSF，混匀，冰上保存数分钟待用； 万方数据山西医科大学博士学位论文>称取100mg肾组织，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0．5-lml的LysisBuffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；>取组织匀浆液转移到1．5mlEP管中，12000rpm，4"C离心裂解物10min；>移上清液于另一新的EP管中，蛋白定量(BCA法)；>分装保存于．70。C，避免反复冻融。③BCA法测定样品蛋白浓度>标准曲线绘制，取一块酶标版，按照下表加入试剂：孔号O1234567蛋白标准液(rtl)0l248121620去离子水(“1)2019181612840对应蛋白含量(rtg)O0．51．02．O4．06．08．O10>将适当稀释后的蛋白样品20斗l加到样品孔中；>根据标准品及待测蛋白样品的数量(每孔需要200lal)，将BCA-试剂A与BCA试；}UB以50：1的比例配制适量的BCA工作液，充分混匀；>各孔加入200pl的BCA工作液，37℃孵育30min>一标准曲线0号管做参比，酶标仪测定570nlTl的吸光度>根据标准曲线计算待测样品蛋白含量(嵋)，除以样品稀释液总体积(20I．t1)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(rtg#t1)。2．2．2蛋sos．聚丙烯酰胺凝胶电泳①配制凝胶：10％分离胶7．5ml去离子水2．95ml30％丙烯酰胺2．5ml1．5mmolTris(PH8．8)1．9ml10％SDS75Ul45 万方数据山西医科大学博士学位论文25％过硫酸胺(AP)TEN匝D积层胶2ml去离子水30％丙烯酰胺1．0mmolTris(PH6．8)10％SDS25％过硫酸胺(AP)TEⅣ匝D注意加入TEMED后应即刻灌胶，②蛋白样品准备209l蛋白样品+51115xloadingbuffer59lmarker+109l5xloadingbuffer100℃沸水煮5．10min，蛋白变性③操作过程35Ul3gl1．4ml330gl250gl20“l8gl2gl以免聚合。>制胶：用lmlJJN样枪将配好混匀的分离胶液从两侧注入已夹好的电泳槽的两块玻璃板之间，再加入2ml蒸馏水，室温下静置约40min后，分离胶聚合完全，将水弃去；将积层胶灌入到分离胶上，并插齿梳，室温30min后将梳子轻轻拔出，将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液；>加样：将准备好的蛋白样品及marker加入孔中，空I刍孑LJJl]109lloadingbuffer：>电泳：恒压，VH模式，积层胶80MV，电泳约40min，蛋白跑至积层胶与分离胶标记处，切换电压为100MV，电泳约90min，溴酚蓝跑至胶底停止电泳；>转膜：将硝酸纤维素膜、滤纸、海绵垫浸泡于转膜缓冲液；将胶小心取出，在Marker所示将相应分子量大小的凝胶切出，按负极_正极顺 万方数据山西医科大学博士学位论文序：海绵垫—6层滤纸—凝胶—硝酸纤维素膜—6层滤纸一海绵垫放好，加满转膜液，STD模式，恒流200MA转膜，根据蛋白分子的大小决定转膜时间；>封闭：5％脱脂奶粉或BSA(不同抗体要求不同)室温、摇床封闭2h>孵一抗：13-actin(兔抗大鼠)，S6(兔抗大鼠)，pS6(羊抗大鼠)，一抗浓度均为l：1000，4。C摇床过夜，TBST洗10min×3；>孵二抗：羊抗兔IgGl：2000，窒温、摇床孵育2h，TBST洗10minx3：>ECL显色：加入ECL化学发光试剂，室温下反应lmin；>曝光：塑料薄膜包裹硝酸纤维素膜，暗室中将X光胶片压于膜上曝光适当时间后，显影，定影；>QuantityOne分析系统对条带做吸光度定量，以p-actin灰度值为基础，分析蛋白的相对表达量。47 万方数据 万方数据 万方数据山西医科大学博士学位论文讨论P13眦／mTORcl通路的紊乱会引起一系列的疾病，包括癌症、神经病变、自身免疫性疾病和造血型疾病[23,241。大量的研究证明，肾脏疾病的发生发展也与P13K／Akt／mTORCl通路有着密切的关联。G／SdelM等人‘251在其研究报道中称，人与小鼠的糖尿病肾病中，mTOR失调会促进肾小球疾病的发展，严格控制mTOR的活性是维持肾小球足细胞功能的关键。基因缺失的复合物1(mTORCl)诱导小鼠足蛋白尿，渐进性肾小球硬化。同时，mTORCl与mTORC2之间关系失衡，也可影响肾小球的病变。Sakaguchi等‘261在STZ诱导的早期糖尿病小鼠上发现雷帕霉素不仅抑制了p70S6激酶的磷酸化，而且还可以下调p20和p27的表达，从而抑制了糖尿病小鼠的近端肾小管上皮的肥大。多囊肾疾病(PI①s)是一种遗传性疾病，特点是在肾脏和其他器官囊肿的形成，最终导致终末期肾脏病[271。NovalicZ等人[281在动物模型中发现，抑制mTORCl对多囊肾有益。在研究中采用高低两个剂量的西罗莫司分别作用在两个PKDl突变小鼠模型的不同阶段，高剂量治疗疾病的早期，可减少肾组织中mTOR的信号，抑制囊肿生成，加速囊肿回归的，并减少纤维化及免疫细胞的浸润；相比之下，低剂量治疗没有显着效果。且mTORCl的活性水平与肾囊肿型的严重程度密切相关。mTOR通路同样在肾细胞癌的发展中起着关键的作用。mTORCl表达增多可引起HIF．1表达上调，从而使VEGF、TNFa、PDGFa分泌增多，促进细胞增殖抗凋亡，从而加速肿瘤生长【291。mTORCl抑制剂依维莫司和西罗莫司在临床实验已用于晚期肾细胞癌的治疗，并显示出强大的潜力‘301。Kramer【9】等人研究结果显示，在系膜增生性大鼠模型(anti-thyl肾小球肾炎)，mTORCl抑制剂雷帕霉素能显著减轻肾小球肾炎的各种症状，抑制系膜细胞的增殖，减少炎性细胞的浸润，及胶原蛋白的沉积。而我们的实验结果也证明，在IgA肾病大鼠中，pS6表达增加，雷帕霉素显 万方数据山西医科大学博士学位论文著抑制pS6的表达。pS6为mTORCl的下游靶分子，经常作为体内mTORCl活动的指标，mTORCl信号通路被激活后，会使S6磷酸化为pS6，雷帕霉素作为mTORCl的特异抑制剂，可以阻断其激活，抑制S6磷酸化，从而保护肾脏。从这些慢性肾脏疾病的动物模型中，我们可以发现表明mTORCl信号是肾脏疾病进展的关键途径，抑制mTORCl可能是治疗慢性肾脏疾病的一个有效方法，尤其应该尝试早期预防治疗。这些有益的结果为人们治疗肾脏疾病提供新的思路。雷帕霉素在肾移植患者已使用多年，最近，雷帕霉素类似物，开始尝试用于治疗转移性肾细胞癌；mTORCl抑制剂在ADPKD患者的潜在治疗作用正在评估和进行临床试验；是否mTORCl抑制剂可以用于治疗DN肾功能衰竭和其他形式的慢性肾病当前尚无定论，还需要进行临床研究。 万方数据山西医科大学博士学位论文小结1、雷帕霉素可以减少蛋白尿，预防血肌酐升高，从而保护肾功能，同时对大鼠体重及肝功能无影响。2、雷帕霉素直接或间接干扰IgAN发展为终末期肾病(ESRD)的多个关键环节：1)减少了IgA的沉积和抑制细胞增殖；2)减少IgA肾病大鼠系膜细胞激活及细胞外基质的分泌；3)下调促纤维化生长因子PDGF和TGF．p1的表达。3、IgA肾病大鼠中mTORCl信号通路被激活，S6磷酸化为pS6，pS6表达升高；雷帕霉素作为mTORCl的特异抑制剂，可以阻断其激活，抑制S6磷酸化。52 万方数据山西医科大学博士学位论文参考文献：【1】．Donadio，J．V．andJ．P．Grande．IgAnephropathy．NEnglJMed，2002．347(10)：738．48【2】．Lai，K．N．，ChanLY,GuoH，TangSC，LeungJC．AdditiveeffectofPPAR-gammaagonistandARBintreatmentofexperimentalIgAnephropathy．PediatrNephrol，2011．26(2)：257-66．[3】．Katzir,Z，Leibovitch，E，Vaknin，H，Sehreiber,L，Berger,E，Matas，Z，Fux,A，Boaz，M，Briliant，A&Biro，A．EffectofatorvastatinonIgAnephropathyintherat．ClinNephrol，2013．79：214—20．[4】．Lu，I／Y,Chert,LZ，Jiang，XY,Mo，YL崦，YH&Sun，LZ．Temporalandspatialexpressionofpodocyte—associatedmoleculesareaccompaniedbyproteinuriainIgAnephropathyratmodel．PhysiolRes，2013．62(1)：35—45．[5】．Xing，L，Bai，L，Yu，CY&Xie，RJ．EffectoftelmisartanontubulointerstitialinjuryandexpressionofPPARgammainratrenaltissueofIgAnephropathymodel．ZhonghuaYiXueZaZhi，2010．90(40)：2860-3．[6】。Stoycheff,N，Pandya，K，Okparavero，A，Schiff,A，Levey,AS，Greene，T&Stevens，LA．Earlychangeinproteinuriaasasurrogateoutcomeinkidneydiseaseprogression：asystematicreviewofpreviousanalysesandcreationofapatient—levelpooleddataset．NephrolDialTransplant,2011．26：848—57．[7】．Diekmann，F，Rovka，J，Carreras，J，Arellano，EM，Banon·Maneus，E，Ramirez-Bajo，MJ，Gutierrez-Dalmau，A，Brunet，M&Campistol，JM．Mammaliantargetofrapamycininhibitionhakstheprogressionofproteinuriainaratmodelofreducedrenalmass．JAmSocNephrol，2007．18：2653—60．[8】．Groth，CGBackman，L，Morales，JM，CaMe，RKreis，H，Lang，只Touraine，几，Claesson，K，Campistol，JM，Durand，D，Wramner,L，Brattstrom,C&Charpentier,B．Sirolimus(rapamycin)-basedtherapyinhumanrenaltransplantation：similar53 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万方数据山西医科大学博士学位论文polycystickidneydisease．TrendsMolMed，2011．17(11)：625—633．【28]．NovalicZ，vanderWalAM，LeonhardWN．Dose—DependentEffectsofSirolimusonmTORSignalingandPolycysticKidneyDisease．JAmSocNephrol，2012．23(5)：842—53．[29]．CostaLJ，DrabkinHA．Renalcellcarcinoma：Newdevelopmentsinmolecularbiologyandpotentialfortargetedtherapies．Oncologist，2007．12：1404_1415．[301．BattelliC，ChoDC．mTORinhibitorsinrenalcellcarcinoma．Therapy,2011．8(4)：359-367． 万方数据山西医科大学博士学位论文第二部分雷帕霉素抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖的机制研究目前，IgA肾病被认为是免疫复合物介导的肾小球肾炎，以IgA的沉积、系膜细胞增生和系膜基质扩张为其主要的病理特点⋯。其中，在动物实验和人类肾小球疾病中已经证明系膜细胞增殖的重要性，系膜细胞增殖最先出现，并促进系膜基质、细胞因子的产生，最终引起肾小球纤维化【2】。所以我们在本部分实验中，专门培养了大鼠系膜细胞，研究雷帕霉素抑制系膜细胞增殖的机制。细胞增殖与细胞周期调节蛋白的作用密切相关。大量的研究证明，细胞增殖最终是由这些在细胞核的蛋白质控制的，细胞周期调节蛋白不仅控制细胞的增殖、肥大，同时影响细胞的凋亡与分化[2-3]，所以肾小球疾病组织损伤与细胞周期调节有着密切的关联。在肾小球系膜增生性模型(anti．Xhyl．1nephritis)中可以发现系膜细胞@cyclinA、D1，CDK2表达增高，肾小球上皮细胞p27表达下调【4-5】；相反，在膜性肾病模型(passiveHeymannephritis，PHN)中，CKI(p21、p27)呈现持续性增高【6】；IgA肾病患者中，系膜细胞增殖和肾小球硬化程度与系膜细胞E2F1的上调及肾小球上皮细J]fgp27。ipl、p57b9减少相关[7】；在培养的系膜细胞中发现，给予不同丝裂原刺激，cyclinA、D1、E，CDK2表达均增加【8】。这些结果说明在不同细胞及不同肾病动物模型中，细胞周期调节蛋白会有不同的表达，在。肾小球对损伤出现不同反应的过程中扮演着重要的角色，肾小球固有细胞细胞周期调控将影响系膜细胞增殖发展为肾小球硬化。所以雷帕霉素通过调节哪些周期调节蛋白而调控系膜细胞增殖，以及通过怎样的信号转导通路是我们这一部分要详细研究的内容。 万方数据山西医科大学博士学位论文实验一雷帕霉素对大鼠系膜细胞增殖及细胞周期、细胞凋亡的影响材料与方法1材料1．1细胞大鼠肾小球系膜细胞(HBZY．1)中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)购买1．2实验仪器微量加样器德国Eppendorf公司SW-CJ．2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司BS210S型Sartorius电子天平北京赛多利斯天平有限公司MDF．U32V低温冰箱日本SANYO公司．70冰箱中国海尔公司电热恒温水浴箱上海伊欧斯实业有限公司SHAC电热恒温水槽常州国华电器公司YXOG02型手提式电热压力蒸汽消毒锅山东安得医疗科技有限公司超纯水设备美国Millipore公司202．0型台式干燥箱北京市永光明医疗仪器厂微型振荡器北京金北德工贸公司TGL．16B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂BRl6型高速冷冻离心机安新县白洋离心机厂JY92．1iD超声波细胞粉碎机宁波海曙科生超声有限公司HEPA—CLASSl00三气组织培养箱美国Thermo公司倒置相差显微镜德国Leica公司滤器上海亚东核级树脂公司 万方数据山西医科大学博士学位论文ESPELITE型流式细胞仪美国COULITER公司WellscanMK3酶标仪芬兰雷勃仪器厂1．3实验用品细胞培养瓶美国Coming公司细胞培养板美国Coming公司冻存管美国Coming公司封口膜北京北方伟业发展公司1．4主要试剂DMEM培养基美国Invitrogen公司青霉素链霉素混合液(100")北京Solarbio公司胎牛血清(FBS)杭州四季青生物工程研究所胰蛋白酶粉剂美国Gibco公司MTT北京Solarbio公司RecombinantPDGF．BB上海生工雷帕霉素瑞士Adamas-beta公司AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒南京凯基生物科技发展有限公司凯基细胞DNA含量检测试剂盒(细胞周期)南京凯基生物科技发展有限公司其余试剂均为市售分析纯1．5试剂配置雷帕霉素称取1．83mg雷帕霉素，溶于2mlDMSO中，浓度为lmmol／1，分装．20℃冻存，使用前用培养基稀释至合适浓度无血清DMEM／F12培养基DMEM培养基500ml青霉素链霉素混合液5ml置于4℃备用完全D№M佰12培养基无血清DMEM培养基450ml灭活FBS50ml 万方数据山西医科大学博士学位论文0．25％胰蛋白酶细胞消化液冻存液PBS平衡盐溶液MTT(5mg／m1)置于4。C备用胰蛋白酶粉剂0．259无菌PBS100ml过滤除菌，分装，．20保存DMEM细胞培养基灭活FBSDMSO无菌条件下按7：2：1体积混合，4。C避光保存NaCl8．09KClO．29NaEl4P04。12H203．499KH2P040．29三蒸水定容至1000mPH值7．2．7．4高压灭菌20分钟，4。C冰箱保存MTT50mgPBS】0ml过滤除菌分装，4。C冰箱避光保存2实验方法2．1I-IBZY．1细胞的复苏、培养、传代及冻存2．1．1复苏>从液氮罐中取出冻存的HBZY．1细胞迅速放入37。C水中，轻轻摇动使之在1分钟内尽快解冻；>吸出细胞悬液并加入5倍体积的完全DMEM培养基，混匀后1000rpm离心5min，弃上清。2．1．2培养>用完全培养基将细胞沉淀吹打混匀，分别转入培养瓶中，加入约5ml培养基， 万方数据山西医科大学博士学位论文置入37℃C02孵箱；>在培养箱中静置24h后，换液除去未贴壁细胞后继续培养；>此后1．2d观察细胞生长状态，如液体变黄而镜下细胞未长满，可以换液，换液时将原培养液弃掉，加入新鲜培养基5ml。2．1．3传代>当细胞长至800／o-100％融合度时即可进行传代。弃去培养液，用预温的PBS液2ml清洗2次，加入0．25％胰蛋白酶lml，室温(20．25℃)下静置l～2min；》倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆变亮、细胞间隙增宽后，弃去胰酶，加入含10％胎牛血清的完全DMEM培养基终止消化。>用毛细吸管充分吹打，使细胞形成细胞悬液，调整细胞密度，接种于新培养瓶中，培养条件不变；>一般为隔天换液，3．5天传代一次。2．I．4冻存>配置冻存液；>取对数生长期的HBZY-1细胞，弃去培养液，用预温的PBS冲洗2遍，加入胰酶消化，终止消化，并移入离心管中；>1000rpm离心5min，弃上清液，按lxl06～lxl07／ml的密度加入冻存液lml，吹打均匀，移入细胞冻存管中，标记名称、时间；>于4"C冰箱30min，．20"C冰箱30rain，．75。C冰箱过夜后置入液氮罐中。以上操作均为无菌操作，注意避免污染。2．2细胞分组对照组(contr01)：给予含0．5％胎牛血清的DMEM培养PDGF组：O．5％DMEM培养基+20ng／mlPDGFPDGF+Rapalnmol／L组：0．5％DMEN培养基+20ng／mlPDGF+lnmol／LRAPPDGF+Rapa10nmol／L组：0．5％DMEN培养基+20ng／mlPDGF+10nmoI／LRAPPDGF+Rapal00nmol／L组：0．5％DMEN培养基+20ng／mlPDGF+100nmol／LRAP61 万方数据山西医科大学博士学位论文PDGF+Rapal000nmol／L组：0．5％DMEN培养基+20ng／mlPDGF+1000nmol／LRAP2．3检测指标及实验方法2．3．1MTT法检测细胞增殖(1)原理：活细胞中脱氧酶能将MTT(四唑盐)还原成不溶于水的蓝紫色产物甲瓒结晶(formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能，甲瓒的生成量与活细胞的数目和功能状态呈正相关，二甲基亚砜(DMSO)可溶解沉积在细胞内的结晶物，在酶标仪上测定吸光度值。MTT是一种较好的反应细胞增殖活力的指标，通过此实验观察RAPA对HBZY．1细胞的增殖情况的影响。(2)操作步骤：》单细胞悬液接种于2个96孔培养板，lxl03～1×104个细胞／孑L，每孔培养基总量200ul，在37。C5％C02的培养箱中培养；>分组的细胞给予药物干预，每组设6个复孔；>药物分别干预20小时、44小时后，每孔加入MTT201．tl(5mg／m1)，继续孵育4h，弃掉培养液，每孔加150p1DMSO，室温振荡lOmin，使结晶物充分融解。>酶标仪检测各孔492nm波长处光吸收值，记录结果，每个试验重复3次。2．3．2流式细胞术检测细胞周期>将培养瓶中细胞消化，制成单细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，5×105个细胞／孔，在C02培养箱中37℃培养24h；>将细胞分组，给予不同药物干预，37"C培养24h；>胰酶消化后分别收集各孔细胞，1000rpm，离心5min，弃上清后再用PBS洗涤一次，并调整细胞浓度为1X105个／ml；>取lml细胞悬液，1000rpm，离心5min，去上清，加入70％预冷的乙醇lml，4。C固定过夜；>用PBS洗去固定液，2000rpm，离心5min，加100I_tlRNaseA37"C水浴30min。62 万方数据山西医科大学博士学位论文>再加入4009lPI进行染色混匀，4。C避光30min；》上流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处荧光。2．3．3流式细胞术检测细胞凋亡>将培养瓶中细胞消化，制成单细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，5x105个细胞／孑L，在C02培养箱中37。C培养24h；>将细胞分为6组，给予不同药物干预，37℃培养24h；>胰酶消化后分别收集各孔细胞，1000rpm，离心5min，弃上清后再用PBS洗涤二次，收集1-5x105个细胞：>加59lAnnexinV．FITC混匀后，加入59lPI混匀；>室温避光反应5～15min：>在1h内上机检测。2．4统计学分析采用SPSSl0．0软件包进行统计学处理，所有数据均以i±s标准差表示。各组间资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)。检验水准为a=0．05。 万方数据山西医科大学博士学位论文结果1、雷帕霉素可以显著抑制大鼠系膜细胞的增殖MTT结果显示，PDGF组HBZY．1细胞的OD值在24h、48h均较对照组明显升高，说明PDGF刺激系膜细胞大量增殖，而给予不同浓度RAPA干预后OD值显著减小，证明RAPA能有效抑制系膜细胞的增殖，且呈浓度依赖性。但是100nmol／L与1000nmol／L组并未见明显差异，无统计学意义，说明药物剂量过大超过一定范围后，其效果并不一定就显著，用药剂量不宜太大。从表中我们可以看出，24h与48h药物作用效果并没有太大差异，所以在时间上一般选择作用24h。表2．1．1各组HBZY．1细胞24h、48hOD值(i士s)点善。妄妒椤≯矿≯矿—≥∥图2．1．1各组HBZY．1细胞24h、48hOD值(i士s)注：与对照组相比，·P<0．05¨P<0．01；与PDGF组相比，}}P<0．05群群P<0．01 万方数据山西医科大学博士学位论文2雷帕霉素将系膜细胞阻滞在GO／GI期细胞周期结果显示：与对照组相比，PDGF组细胞G0／G1期比例减少，S期细胞比例增加(尸<0．05)，说明PDGF刺激HBZY．1细胞进入增殖周期。与PDGF组比较，RAPA干预组均表现为G0／Gl期细胞比例显著增加，而S及G2期细胞比例下降(砌．05)，且称呈剂量依赖性，说明RAPA可使细胞停滞于G0／G1期，具有抑制细胞增殖的作用。但是同MTT结果相似100nmol／L与1000nmol／L组差异无统计学意义。表2．1．2各组细胞细胞周期的变化(i士s)善苜虽墨罡亏。图2．1．3各组细胞细胞周期的变化(元士s)注：与对照组相比，‘PO．05)，说明雷帕霉素不引起系膜细胞的凋亡。Ann．V．FfTCAnmV．FITCAnn-V—FITCAnn-V．FrrCAnn．V．FITC2．1．4流式细胞术检测各组HBZY-1细胞的凋亡情况67 万方数据山西医科大学博士学位论文表2．1．3流式细胞术检测HBZY-1细胞凋亡率比较(又士s)分组细胞凋亡率(％)contr01(n=6)PDGF组(n--6)1．2士0．1l2．8士O．35Rapa1nmoI／L(n=6)0．9+0．17Rapa10nmoI／L(n=6)1．1士0．90Rapa100nmoi／L(n=6)1．9+0．28Rapa1000nmol／L(n=6)2．6+0．37 万方数据山西医科大学博士学位论文讨论系膜细胞增殖是IgA肾病最主要的病理改变，通过培养系膜细胞，药物干预及MTT检测发现雷帕霉素能有效的抑制系膜细胞的增殖。MTT是一种检测细胞存活和生长的方法，根据其检测原理，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。MTT试验结果表明，PDGF组HBZY．1细胞的OD值在24h、48h均较对照组明显升高，说明PDGF刺激系膜细胞大量增殖，而给予不同浓度RAPA干预后OD值显著减小，证明RAPA能有效抑制系膜细胞的增殖，且呈浓度依赖性。但是100nmol／L与1000nmol／L组并未见明显差异，无统计学意义，说明药物剂量过大超过一定范围后，其效果并不一定就显著，用药剂量不宜太大。从结果中我们可以看出，24h与48h药物作用效果并没有太大差异，所以在时间上一般选择作用24h。系膜细胞增多可能有两个原因，首先是细胞进入增殖周期，分裂加速：其次是由于细胞凋亡减少【3】，所以我们接下来分别检测了雷帕霉素对细胞周期及细胞凋亡的影响。细胞增殖与细胞周期密切相关，是细胞周期不断循环周而复始引起细胞分裂的结果。细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂完成为止所经历的全过程或间隔时间，主要分为4个阶段：G1期、S期、G2期和M期。G1期是DNA合成前期，主要进行RNA和蛋白质的合成；S期是DNA合成期；G2期是DNA合成后期，主要合成有丝分裂中新细胞形成所必需的物质；细胞在不适宜的条件下会减慢或停止分裂，细胞周期停滞在G1期，称为G0期‘9qo]。QuiescentDNAsynthesisProliferationG0一G1_二：_≮s—G2—弋■M▲’、▲HypertrophyApoptosisDifferentiation我们的结果显示，雷帕霉素呈剂量依赖性的将周期阻断在GO．G1期，流式 万方数据山西医科大学博士学位论文细胞术分析可见PDGF组G0／G1细胞比例显著减少，而RAPA干预组可明显增加G0／G1期细胞百分比，减少处于S、G2期细胞的百分比，从而抑制细胞周期的进程，抑制细胞的增殖；但是与MTT结果相似100nmol／L与1000nmol／L组差异无统计学意义。雷帕霉素不影响系膜细胞的凋亡，与EspositoC[111等人的研究结果一致。70 万方数据山西医科大学博士学位论文实验二雷帕霉素对大鼠系膜细胞细胞周期蛋白的作用材料与方法1材料1．1细胞大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)购买1．2实验仪器微量加样器德国Eppendorf公司SW二CJ．2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司BS210S型Sartorius电子天平北京赛多利斯天平有限公司MDF．U32V低温冰箱日本SANYO公司．70冰箱中国海尔公司电热恒温水浴箱上海伊欧斯实业有限公司SHAC电热恒温水槽常州国华电器公司YXOG02型手提式电热压力蒸汽消毒锅山东安得医疗科技有限公司超纯水设备美国Millipore公司202．0型台式干燥箱北京市永光明医疗仪器厂微型振荡器北京金北德工贸公司TGL．16B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂BRl6型高速冷冻离心机安新县白洋离心机厂JY92．IID超声波细胞粉碎机宁波海曙科生超声有限公司旺PA—CLASS100三气组织培养箱美国Thermo公司倒置相差显微镜德国Leica公司滤器上海亚东核级树脂公司WellscanMK3酶标仪芬兰雷勃仪器厂24D型迷你双垂直电泳仪北京市六一仪器厂 万方数据山西医科大学博士学位论文DYCZ．40D型迷你转印电泳仪DYY．11型电脑三恒多用电泳仪电源WD．9465B型水平摇床QuantityOne分析系统1．3实验用品细胞培养瓶细胞培养板冻存管封口膜1．4主要试剂DMEM培养基青霉素链霉素混合液(100")胎牛血清(FBS)胰蛋白酶粉剂RecombinantPDGF．BB雷帕霉素二甲基亚砜(DMSO)Tween．20甘氨酸Tris碱5×蛋白上样LoaddingBufferAcrylamide丙烯酰胺N，N’．亚甲基双丙烯酰胺Ammoniumpersulfate过硫酸铵TEⅣ匝D脱脂奶粉72北京市六一仪器厂美国BIO．RAD公司美国Corning公司北京北方伟业发展公司美国Invitrogen公司北京Solarbio公司杭州四季青生物工程研究所美国Gibco公司上海生工瑞士Adamas．beta公司美国Sigma公司北京Solarbio公司上海生工北京Solarbio公司美国BD公司 万方数据山西医科大学博士学位论文彩色预染超高分子量蛋白质标准硝酸纤维素膜SuperSignalaWestPico化学发光底物光胶片(5x7)显影粉、定影粉全蛋白抽提试剂盒(KGP250)磷酸化蛋白提取试剂盒BCA蛋白浓度测定试剂盒p27KiplAntibodyp57Kip2AntibodycyclinD1(H一295)AntibodycyclinEAntibodyCDK2AntibodyCDK4Antibodyfl-actinAntibodygoatanti-rabbitIgG-HRPgoatanti--mouseIgG··HRP其余试剂均为市售分析纯1．5试剂配置武汉博士德生物美国Pierce美国柯,-j达大幽1砼天津双翼化工公司南京凯基生物科技发展有限公司美国CellSignalingTechnology美国CellSignalingTechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology美国SantaCruzBiotechnology雷帕霉素称取1．83mg雷帕霉素，溶于2mlDMSO中，浓度为1mmol／1，分装．20"C冻存，使用前用培养基稀释至合适浓度无血清DMEM培养基DMEM培养基500ml完全DMEM培养基青霉素链霉素混合液置于4"C备用无血清DMEM培养基灭活FBS5ml450ml50ml 万方数据山西医科大学博士学位论文0．25％胰蛋白酶细胞消化液PBS平衡盐溶液置于4。C备用胰蛋白酶粉剂0．259无菌PBS100ml过滤除菌，分装，．20保存NaCI8．09KCl0．29Na2HP04。12I-120‘3．499KH2P04O．29三蒸水定容至1000mPH值7．2．7．4高压灭菌20分钟，4"C冰箱保存WesternBlotting试剂配置同前2实验方法2．1I-IBZY．1细胞的复苏、培养、传代及冻存2．1．1复苏>从液氮罐中取出冻存的HBZY．1细胞迅速放入37。C水中，轻轻摇动使之在1分钟内尽快解冻；>吸出细胞悬液并加入5倍体积的完全DMEM培养基，混匀后1000rpm离心5min，弃上清。2．1．2培养>用完全培养基将细胞沉淀吹打混匀，分别转入培养瓶中，加入约5ml培养基，置入37。CC02孵箱；>在培养箱中静置24h后，换液除去未贴壁细胞后继续培养；》此后1．2d观察细胞生长状态，如液体变黄而镜下细胞未长满，可以换液，换液时将原培养液弃掉，加入新鲜培养基5ml。2．1。3传代>当细胞长至80％-100％融合度时即可进行传代。弃去培养液，用预温的PBS74 万方数据山西医科大学博士学位论文液2ml清洗2次，加入0．25％胰蛋白酶Iml，室温(20．25℃)下静置1-2min；>倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆变亮、细胞间隙增宽后，弃去胰酶，加入含10％胎牛血清的完全DMEM培养基终止消化。>用毛细吸管充分吹打，使细胞形成细胞悬液，调整细胞密度，接种于新培养瓶中，培养条件不变；>一般为隔天换液，3．5天传代一次。以上操作均为无菌操作，注意避免污染。2．2细胞分组对照组(contr01)：给予含0．5％胎牛血清的DMEM培养PDGF组：0．5％DMEM培养基+20ng／mlPDGFPDGF+RapalOnmo儿组：0．5％DMEN培养基+20ng／mlPDGF+10nmol／LRAPPDGF+Rapa100nmolA,组：0．5％DMEN培养基+20ng／mlPDGF+100nmol／LRAP干预24h后收集细胞，提取蛋白。2．3蛋白提取及Westernblotting分析肾皮质多种蛋白表达2．3．1细胞蛋白提取①凯基全蛋白提取试剂盒组份(50tests)LysisBuffer50ml磷酸酶抑制剂5001xl蛋白酶抑制剂50I_tlPMSF(100mM)5001xl②蛋白提取步骤>在每lml冷LysisBu毹r力口入10“l磷酸酶抑制剂，1¨l蛋白酶抑制剂和10I．tlPMSF，混匀，冰上保存数分钟待用；>贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入冷PBS洗两次；>加入胰酶消化细胞后收集，移至离心管中，1000rpm离心10min，弃上清； 万方数据山西医科大学博士学位论文>将细胞移入1．5mlEP管中，PBS洗两次后，加入上述配好的冷LysisBuffer0．2ml～0．5ml，4"C，15mira>14000rpm，4"C离心裂解物20min；>移上清液于另一新的EP管中，蛋白定量(BCA法)；>分装保存于．70。C，避免反复冻融。⑨BCA法测定样品蛋白浓度>标准曲线绘制，取一块酶标版，按照下表加入试剂：孔号01234567蛋白标准液(u1)O1248121620去离子水(Ixl)2019181612840对应蛋白含量(rtg)O0．51．02．04．06．08．010>将适当稀释后的蛋白样品20斗l力口到样品孔中；>根据标准品及待测蛋白样品的数量(每孔需要200I_t1)，将BCA试剂A与BCA试剂B以50：1的比例配制适量的BCA工作液，充分混匀：>各孔加入200“l的BCA工作液，37。C孵育30min>一标准曲线0号管做参比，酶标仪测定570nlll的吸光度>根据标准曲线计算待测样品蛋白含量(rtg)，除以样品稀释液总体积(20111)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(I．tg／p1)。2．3．2蛋tjsDs．聚丙烯酰胺凝胶电泳具体方法参见第一部分实验三。2．4Real-timePCR；t险测mRNA的表达量2．4．1细胞总RNA提取一采用Trizol抽提总RNA>细胞处理完毕后，胰酶消化收集细胞。每5×106～1×10‘7细胞加入lml，充分吹打混匀，转移到1．5ml离心管中取上清；>加入0．2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min；>12000rpm，4。C离心15min，离心后混合物分离为三层：包含RNA的无色上清液，中间白色酚．氯仿相，底层为浅红色有机相；>小心吸取上层水相(200．300u1)到另一新的1．5ml离心管中，不要吸取 万方数据山西医科大学博士学位论文任何中间层物质；>加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min；》12000rpm，4。C离心10min，一般在离心后，管底会出现沉淀，即为RNA：>小心弃去上清，缓慢沿管壁加入75％乙醇洗涤RNA沉淀，12000rpm，4。C离心5min，小心弃去乙醇；>室温干燥2．5分钟，用适量的DEPCH20溶解RNA；》RNA的分析和定量：测定样品在260nm和280nm的吸光度值，mRNA浓度(g／L)=OD260x核酸稀释倍数x40／1000计算mRNA浓度(或按1OD260=4099计算RNA产率)：00260／280在1．8—2．0视为RNA纯度理想；>mRNA完整性的鉴定：进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察28S、18S、5S条带的宽度和亮度，以判断RNA有无降解。2．4．2PCR引物设计根据GeneBank中大鼠的Gapdh、p27的cDNA序列和PCR引物设计原则，请TaKaRa公司进行引物设计，用计算机引物设计软件‘'PremierPrimer5”进行评价。表2．2．1引物设计2．4．3RealtimePCR及定量方法具体方法参见第一部分实验二 万方数据山西医科大学博士学位论文2．5统计学分析采用SPSS10．0软件包进行统计学处理，所有数据均以i±s标准差表示。各组间资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，检验水准为a=O．05。 万方数据山西医科大学博士学位论文结果1、雷帕霉素对大鼠系膜细胞细胞周期蛋白的影响1．1雷帕霉素不影响CyclinD1、CyclinE的表达分别提取各组细胞的总蛋白，进行Westernblotting检测CyclinD1、CyclinE蛋白表达，结果可见对照组CyclinD1、CyclinE表达较低，而PDGF组CyclinD1、CyclinE表达上调，与对照组比较有统计学意义(氏O．05)，说明PDGF刺激系膜细胞进入细胞增殖周期。而凡廿A干预组可发现，10nmol／L与100nmol／L条带均较PDGF组无明显改变，与PDGF组间无统计学差异(胗0．05)。说明雷帕霉素不影响CyclinD1、CyclinE的表达。表2．2．2各组细胞CyclinD1、CyclinE蛋白表达的相对量(i士s)注：与对照组相比，·P<0．0579 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据山西医科大学博士学位论文∥舻妒扩≥矿拶表2．2．4各组细胞1327kipmRNA表达的相对量(RT-PCR)注：与对照组相比，’P<0．05；与PDGF组相比，群P<0．05 万方数据山西医科大学博士学位论文讨论细胞周期主要由细胞周期蛋白来进行自身调控，通过细胞周期素或称周期蛋白(cyclin)随细胞周期不同时期进行合成与降解；通过周期素依赖性蛋白激酶(CDK)有序磷酸化和去磷酸化来调节：同时也由CDK抑制因子(CⅪ)时相变化检查点对DNA损伤及复制作出反应加以调控来实现。细胞周期每一个阶段都会由正调控蛋白(cyclinandCDKs)及负调控蛋白(CKI)来进行调控‘12】。Cyclin通过与CDKs结合形成cyclin．CDKs复合物共同控制着细胞周期，使细胞严格按照G1期．S期．G2期．M期的顺序连续进行复制【13】。细胞由静止G0期进入G1期需要cyclinD(D1，D2，D3)，在一些生长因子的刺激下，cyclinD表达水平升高；cyclinD与CDK4或CDK6结合，进入胞核，形成cyclinD与CDK4／6的复合物，从而激活下游途径启动细胞DNA复制，促使细胞通过G1／S调控点；而cyclinE则主要G1期后期表达，与CDK2结合，在G1／S期交界点达到表达高峰进而发挥作用；CyclinA主要出现G1后期，在S期表达量到高峰，且持续至G2期，cyclinA结合并激活CDK2，cyclinA．CDK2为DNA复制所必须的。Cyclin．CDKs复合物可被CDK抑制因子(CKI)负调控，CKI为一种小分子蛋白，可以与Cyclin．CDKs复合物结合而抑制其激活[5】。CKI有两个家族，而我们主要关注Cip／Kip家族，包括p21、p27、p57，可以阻断G1早期(cyclinD—CDK4／6)，G1晚期(cyclinE-CDK2)及S期(cyclinA-CDK2)。p21在正常肾小球不表达，而p57只在肾小球上皮细胞表达，p27则在肾小球所有类型的细胞中均有持续表达，且主要影响cyclinE．CDK2的活性[14-15】，所以在实验中我们主要关注p27表达量的变化。Quie$contDNAsynthesisProliferationCyclinD1，2。3CyclinECyclinACyclinGo——————————■-．G1———————————◆S——————————_I’G2———————————◆MCDK4，5，6CDK2CDC2／人＼＼T夕匪困匪圃 万方数据山西医科大学博士学位论文在我们前面的实验一中可以看到，雷帕霉素在10舢∞扎及100啪。组可明显将细胞周期阻断在GO．G1期，抑制周期进入S期，所以我们主要检测了这两个浓度对cyclmD、CDK4与cyclmE、CDK2蛋白表达的影响。结果显示，PDGF组CyclmD1、CyclmE及CDK2、CDK4表达上调，说明PDGF刺激系膜细胞进入细胞增殖周期。但雷帕霉素并不影响这些蛋白量的表达，与PDGF组比较并无明显差异。所以接下来我们又检测了p27，WeStemBloU崦与realthne．PCR检测结果均证实，PDGF可引起p27表达水平显著降低，而雷帕霉素则可增加p27的蛋白表达，100mo儿较10砌01／L组虽然差异无统计学意义，但从Western图中可以看出，其效果更为明显，这一结果提示RAPA通过调控转录翻译，增加p27蛋白表达，从而抑制cyclinE．CD勉的活性，阻断细胞周期由GO．G1期进入S期。 万方数据山西医科大学博士学位论文实验三雷帕霉素对mTORCl及ERKl／2信号通路的影响材料与方法1材料1．1细胞大鼠肾小球系膜细胞(HBZY．1)中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)购买1．2实验仪器同第二部分实验二1．3主要试剂AktAntibody美国CellSignalingTechnologyPhospho-Akt(Ser473)Antibody美国CellSignalingTechnologyP70S6KinaseAntibody美国CellSignalingTechnologyPhospho-P70S6Kinase(Thr389)Antibody美国CellSignalingTechnologyp44／42MAPK(Erkl／2)RabbitmAb美国CellSignalingTechnologyPhospho—p44／42MAPK(Erkl／2)(Thr202／Tyr204)RabbitmAb美国CellSignalingTechnologygoatanti—rabbitIgG—HRP美国SantaCruzBiotechnologygoatanti-mouseIgG-HRP美国SantaCruzBiotechnology其余试剂同第二部分实验二2．实验方法2．1细胞分组对照组(contr01)：给予含0．5％胎牛血清的DMEM培养PDGF组：0．5％DMEM培养基+20ng／mlPDGFPDGF+Rapa10nm01／L组：0．5％DMEM培养基+20ng／mlPDGF+10nm01／LRAPPDGF+Rapa100nrn01／L组：0．5％DMEM培养基+20ng／mlPDGF+100nmol／LRAPPDGF+Rapal000nmol／L组：0．5％DMEM培养基+20ng／mlPDGF+1000nmol／LRAP 万方数据山西医科大学博士学位论文干预2h后收集细胞，提取蛋白。2．2Westernblotting具体方法步骤见第一部分实验三。 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据山西医科大学博士学位论文讨论目前发现，与细胞增殖密切相关的两条信号通路为P13刚Akt／mTOR和MAP科ERKl／2。P13科Akt／mTOR作为细胞内非常重要的信号转导途径，在细胞的生长、存活、增殖、凋亡等过程中发挥着极其重要的生物学功能‘16】。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)是一种丝／苏氨酸蛋白激酶，在调控许多通路的信号传导中发挥着重要作用，包括胰岛素信号、营养传感信号和有丝分裂信号‘17]。细胞中mTOR以两种复合物的形式存在mTORCl和mTORC2：mTORCl是由mTOR、G13L和Raptor构成，FKBPl2．雷帕霉素可与该复合物结合从而抑制其效应㈣。mTORCl通过影响核糖体S6激酶(40Sribosomal6kinase，S6K)和真核细胞启动因子4E结合蛋白1(eukaryoticinitiationfactor4Ebindingproteinl，4EBPl)磷酸化实现调节mRNA翻译㈣、核糖体生物合成Ⅲ、营养代谢㈨和自噬【221等重要功能。mTORC2由roTOR、GJBL和Rictor构成，不能与FKBPl2．rapamycin结合，其活性不受雷帕霉素抑制㈣。mTORC2调节细胞内骨架蛋白的排列㈨，最近的研究还证实Rictor-mTOR是Akt／PKB激活所必须的【25】。了：州6———t●：碧PiP2一半PiP3一PDK',IP2DK棚野——●q■■■■p一：：01擎／I一丫如I毫：：誊1．1。""2-0叫乞：：2÷+Ⅳ!馨9—◆压墅园—卜·Tsco，：e：，嬉136∞0elo。’童t：--——卅—■叠山。、堕毫{：堕璺)鬻焉?一上P13K／Akt／mTOR信号转导通路图9l 万方数据山西医科大学博士学位论文MAPK家族是连接细胞膜表面受体与决定性基因表达之间的重要信号调节酶之一，在细胞的增殖、分化、存活和程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)等功能和过程中发挥着重要的调节作用‘261。经典的MAPK主要包括：胞外信号调节激酶(ERK、也称p44／42)，c-JunN-末端蛋白激酶(JNK)，又称为应激活化蛋白激酶(SAPK))牙Up38MAPK。现在我们关注的是P13K／Akt／mTOR信号通路与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的相互作用。mTOR抑制剂依维莫司和西罗莫司在临床实验已用于晚期肾细胞癌的治疗，并显示出强大的潜力[27-28]。但临床．E发现其治疗效果只对一部分人敏感，而一部分人会出现耐药的问题，其具体机制尚不清楚，可能与反馈性激活Akt通路有关‘291。研究发现，雷帕霉素用于抗肿瘤治疗时，可导致P13K／Akt及Ras／Raf／ERK信号通路的．激活，出现耐药现象[30-31]。其可能的机制为正常状况下，mTORCl活化导致P70S6K活化，活化的P70S6K可磷酸化IRS．1，从而反馈抑制P13K的活化。mTORCl被抑制后，P70S6K活化水平降低，反馈抑制机制被打破，从而导致P13K的激活，P13K激活后作用于下游的AKT及Ras／Raf／ERK，导致其活化【32l。现在研究大多是肿瘤细胞，可在我们的实验中发现，1000nmol／L霄帕霉素作用于系膜细胞时，其抑制效果与100nmoVL并无明显差异，是否1000nmol／L雷帕霉素在系膜细胞中也反馈激活P13K／Akt及Ras／Raf／ERK信号通路，从而减弱了其抑制效果呢?所以我们检测了不同浓度雷帕霉素对P70S6K、AKT及呲¨一●嘣 万方数据山西医科大学博士学位论文ⅡⅨl／2及各自磷酸化蛋白表达的影响，结果显示雷帕霉素剂量依赖性的抑制PDGF引起的P70S6K磷酸化，1000nmol／L抑制作用最强：10及100nmol／L雷帕霉素对PDGF刺激升高的p-AKT及p-ERKl／2均未见显著影响，1000nmol／L干预时，p-AKT、p-ERKl／2较10及100nmol／L组的蛋白表达量略有升高。所以我们推断，雷帕霉素通过mTORCl／P70S6K通路调控p27mRNA转录，增加其蛋白表达；在大鼠系膜细胞中，大剂量的使用雷帕霉素可能会反馈激活AKT及Ras／Ra绝RK，从而减弱雷帕霉素抑制细胞增殖的效果。 万方数据山西医科大学博士学位论文小结1、雷帕霉素呈剂量依赖性的抑制PDGF引起的系膜细胞增殖，阻断细胞周期在GO．G1期，但100nmol／L与1000nmoI／L组并未见明显差异；雷帕霉素不影响系膜细胞的凋亡。2、雷帕霉素并不影响PDGF组上调的CyclinD1、E及CDK2、4表达量；但可以通过调控p27mRNA的转录，增加蛋白表达，从而抑制cyclinE—CDK2的活性，阻断细胞周期由GO．G1期进入S期。3、雷帕霉素剂量依赖性的抑制PDGF引起的P70S6K磷酸化，1000nmol／L抑制作用最强；10及100nmol／L雷帕霉素对PDGF刺激升高的P．AKT及p-ERKl／2均未见显著影响，1000nmol／L干预时，p-AKT、p-ERKl／2较lO及100nm01／L组的蛋白表达量略有升高。所以我们推断，雷帕霉素通过mTORCl／P70S6K通路调控p27mRNA转录，增加其蛋白表达；在大鼠系膜细胞中，大剂量的使用雷帕霉素可能会反馈激活AKT及Ras／Raf／ERK，从而减弱雷帕霉素抑制细胞增殖的效果。 万方数据山西医科大学博士学位论文参考文献：【1】LaiK．N．PathogenesisoflgAnephropathy．NatRevNephr01．2012．8(5)．275．283[2】ShanklandS．J．Cellcycleregulatoryproteinsinglomerulardisease．KidneyInt．1999．56(4)．1208-1215【3】ShanklandS．J．，WolfG．Cellcycleregulatoryproteinsinrenaldisease：roleinhypertrophy，proliferation，andapoptosis．AmJPhysiolRenalPhysi01．2000．278(4)．F515一F529[4】SchocklmarmH．0．，LangS．，SterzelR．B．Regulationofmesangialcellproliferation。KidneyInt．1999．56(4)．1199—1207[5】TeradaY．，InoshitaS．，NakashimaO．，KuwaharaM．，SasakiS．，MarumoF．Cyclinsandthecyclin-kinasesystem--theirpotentialrolesinnephrology．NephrolDialTransplant．1998。13(8)．1913—1916[6】ShanklandS．J．，F10egeJ．，ThomasS．E。，NangakuM。，HugoC．，PippinJ．，HenneK．，HockenberryD．M．，JohnsonR．J．，CouserW．G。Cyclinkinaseinhibitorsareincreasedduringexperimentalmembranousnephropathy：potentialroleinlimitingglomerularepithelialcellproliferationinvivo．KidneyInt．1997．52(2)．404—413[7】QiuL．Q．，SirmiahR．，HsuS．I．Roleofdifferentialandcelltype—specificexpressionofcellcycleregulatoryproteinsinmediatingprogressiveglomerular蜘ur)，inhumanIgAnephropathy．LabInvest．2004．84(9)．1112-1125[8】ShanklandS．J．，PippinJ．，FlanaganM．，CoatsS．R．，NangakuM．，GordonK．L．，RobertsJ．M．，CouserW．G．，JohnsonR．J．MesangialcellproliferationmediatedbyPDGFandbFGFisdeterminedbylevelsofthecyclinkinaseinhibitorp27Kip1．KidneyInt．1997．51(4)．1088-1099[9】KoulaouzidouE．A．，TouplikiotiP．，ZioutiF．，PapazisisK．T．Effectsofadentaladhesiveoncellcycleregulatoryproteins．DentMaterJ．2013．32(6)．986-991 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万方数据山西医科大学博士学位论文megakaryocytes：roleinendomitosis．Blood．1999．94(4)．1273—1282【27】BattelliC．，ChoD．C．mTORinhibitorsinrenalcellcarcinoma．Therapy．2011．8(4)．359·367[28]VossM．H．，MolinaA．M．，MotzerR．J．mTORinhibitorsinadvancedrenalcellcarcinoma．HematolOncolClinNorthAm．2011．25(4)．835—852【29]PalS．K．，WilliamsS．，JosephsonD．Y．，CarmichaelC．，VogelzangN．J．，QuinnD．I．Noveltherapiesformetastaticrenalcellcarcinoma：effortstoexpandbeyondtheVEGF／mTORsignalingparadigm．MolCancerTher．2012．1l(3)．526-537[30]ShawR．J．，BardeesyN．，ManningB．D．，LopezL．，KosmatkaM．，DePinhoR．A．，CantleyL．C．TheLKBltumorsuppressornegativelyregulatesmTORsignaling．CancerCell．2004．6(1)．91-99【31]ManningB．D．BalancingAktwithS6K：implicationsforbothmetabolicdiseasesandtumorigenesis．JCellBi01．2004．167(3)．399—403[32】CarracedoA．，MaL．，Teruya·FeldsteinJ．，RojoF．，SalmenaL．，AlimontiA．，EgiaA．，SasakiA．T．，ThomasG．，KozmaS．C．，PapaA．，NardellaC．，CantleyL．C．，BaselgaJ．，PandolfiP．P．InhibitionofmTORClleadstoMAPKpathwayactivationthroughaP13K-dependentfeedbackloopinhumancancer．JClinInvest．2008．118(9)．3065-3074 万方数据山西医科大学博士学位论文结论皇口，匕本课重点研究了雷帕霉素在IgA肾病大鼠模型中的治疗效果及作用机制，同时探讨了雷帕霉素与系膜细胞周期调控蛋白及Akt／mTORCl与系膜细胞增殖的关系。综合上述实验结果，我们得出以下结论：1、在IgA肾病大鼠中mTOR通路被激活，早期小剂量应用mTOR抑制剂雷帕霉素可阻断mTOR通路；同时雷帕霉素减少蛋白尿及IgA的沉积，阻断肾小球系膜细胞叫C)、细胞因子和细胞外基质(ECM)之间的相互促进作用，从而减缓IgA肾病大鼠的肾损伤。2．雷帕霉素通过mTORCl／P70S6K通路调控p27mRNA转录，增加其蛋白表达，从而抑制cyclinE．CDK2的活性，阻断细胞周期由G0．G1期进入S期，抑制细胞的增殖；在大鼠系膜细胞中，大剂量使用雷帕霉素(大于1000nmol／L)可能会反馈激活AKT及Ras胁伲IⅨ，从而减弱雷帕霉素抑制细胞增殖的效果。但整个实验仍存在许多不足之处，如雷帕霉素单独使用抑制蛋白尿的效果并不是非常出众，不能减少肾小球已经沉积的IgA免疫复合物；mTORC2在大鼠细胞增殖及IgA肾病发展过程中扮演着什么角色；AKT／mTOR及Ras／Raf／ERK存在哪些相互作用；使用雷帕霉素会反馈激活AKT及Ras／Raf／ERK的具体作用机制，在肿瘤细胞中目前有多种推断，那么系膜细胞是否也存在，这些问题尚需要我们做迸一步的研究。 万方数据山西医科大学博士学位论文·综述·哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在肾病中的作用田继华综述李荣山审校(山西医科大学附属人民医院，山西省肾脏病研究所，太原030001)【摘要】大量的研究已经认识到的roTOR在许多肾脏疾病发展中起重要作用。mTOR的活化在介导AKI后肾功能恢复和修复中起重要作用，抑制mTOR会延迟肾功能恢复。而其在许多其他肾脏疾病的活化已被证明是有害的，mTOR活化可加重糖尿病和慢性肾脏疾病的进展；另外，mTOR在ADPKD过度激活可增加囊肿的形成和促进肾衰竭；同时mTOR是在某些肾癌患者中也是重要致病因素。这些认识为人们治疗肾脏疾病提供新的思路。【关键词】mTOR；雷帕霉素；肾病雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)是1975年从吸水性链霉菌发酵液中提取出来的一种低毒性大环内酯类抗生素，是安全有效低毒的新型免疫抑制剂，为mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)抑制剂【1】。mTOR是蛋白激酶家族中新的一员，这类蛋白激酶又属于磷酯酰肌醇激酶相关激酶(PIKK)，roTOR在细胞增殖、分化、转移和存活中具有重要地位[2】。mTOR是～种丝／苏氨酸蛋白激酶，在调控许多通路的信号传导中发挥着重要作用，包括胰岛素信号、营养传感信号和有丝分裂信号【3】。细胞中roTOR以两种复合物的形式存在：mTORCl和mTORC2。mTORCl是由mTOR、G13L(G—Proteinl3一subunit-likeprotein，GpL)和Raptor(regulatoryassociatedproteinofmTOR，Raptor)构成，FKBPl2-rapamyein可与该复合物结合从而抑制其效应[41。基金项目：山西省科技攻关项目(20120313021．1)作者单位：030012，太原，山西医科大学附属人民医院山西省肾脏病研究所通信作者：李荣山，Emaihrongshanlil3@163．com100 万方数据山西医科大学博士学位论文Raptor-mTOR通过影响核糖体S6激酶(40Sribosomal6kinase，S6K)和真核细胞启动因子4E结合蛋白1(eukaryoticinitiationfactor4EbindingproteinI，4EBP1磷酸化实现调节mRNA翻译‘51、核糖体生物合成【6】、营养代谢‘71和自喇81等重要功能。mTORC2由mTOR、GDL和Rictor(rapamycin-insensitivecompanionofmTOR，Rictor)构成，不能与FKBPl2一rapamycin结合，其活性不受rapamycin抑制‘91。Rictor．mTOR调节细胞内骨架蛋白的排列【10】，最近的研究还证实Rictor-mTOR是Akt／PKB激活所必须的⋯】。1．mTORCI的上游调控mTORCl的活化开始于磷脂酰肌醇3．激酶(P13K)的激活，P13K主要通过两种方式激活，一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而被激活；另一种是通过Ras和pll0直接结合导致P13K的活化【l21。P13K被激活后，在质膜．卜产生第二信使PIP3，然后PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDKl结合，促使PDKl磷酸化Akt蛋白Ser308导致Akt的活化；另外Akt蛋白Thr473可以被Rictor．mTOR磷酸化而活化，Akt的两个关键位点磷酸化后得以完全激活ll引。Akt／PKB是Insulin／P13K信号通路的关键分子，通过其下游底物，如FOXO家族的转录因子等调节细胞牛存和增殖【14】；同时活化的Akt通过磷酸化作用激活mTOR信号通路。AKT受到两个基因即位于下游的TSCl／TSC2和上游的PTEN的调节。首先，AKT通过直接磷酸化TSC2的serine939，serinel086，serinel088，和threoninel422，减弱TSCI／TSC2复合物和质膜的关系，进而失去GAP活性，减小对Rheb抑制‘15】，间接活化mTOR。其次，在PTEN／P13刚AKT通路中，PTEN是AKT的负性调节子，它能使第■信使PIP3脱磷酸化为PIP2而失活，生理情况下，PIP3是生长因jr的刺激下P13K磷酸化PIP2后形成的，PIP3能和AKT的PH结构域结合，让后者易位至质膜上，接受PDKI的磷酸化后激活【l6|。2．mTORCI的下游效应mTOR稳定状态下主要存在细胞胞质内，激活后进入胞核调控下游靶分子10l 万方数据山西医科大学博士学位论文真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBPl)署I核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(P70S6K)，调控蛋白质的合成和细胞周期的演进，参与细胞因子和相应受体之间的作用及转导跨膜信号。mTOR在细胞周期调控和蛋白合成当中处于核心地位，目前研究最多最清楚的是mTOR调节蛋白质翻译的功能。mTOR是通过影响靶分子S6K1和4EBPl丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化发挥作用‘17】。S6K1激活后使核糖体S6蛋白磷酸化，磷酸化的S6选择性增加含5'-TOP(5'-TerminalOligopyrimidine)mRNA的翻译，这些mRNA主要编码核糖体蛋白和其他翻译调节物，用这种方式S6K1增加整个细胞的蛋白质合成能力；真核细胞mRNA翻译的启动是由一系列真核细胞启动因子(eukaryoticinitiationfactors，elF)调节的，非磷酸化4EBPl结合真核细胞启动因子4E(eukaryoticinitiationfsctor4E，elF4E)，阻止eIF4F复合物形成，从而抑制cap．dependentmRNA翻译；4EBPl被磷酸化后与eIF4E分离，eIF4E与elF4G和其它相关蛋白形成eIF4F复合物识别、促进cap．dependentmRNA翻译【l81。过度表达elF4E可增加一些具有生长促进作用蛋白的表达，如：cyclinDl、c．Myc和VEGF，促进细胞生长、分化【191。一击⋯羽旷熹蘑臀叼剐"～卧’1鼍≥_‘宅誉等蛩+，拶一哑一罕一嚣裟嚣，鼍●：’：S---K’‘Ee9a、／P13K／Akt／mTOR信号转导通路图暑刑一一鼬．一冀旦§ 万方数据山西医科大学博士学位论文3．mTORCl在肾病中的作用P13K／Akt／mTOR通路的紊乱会引起一系列的疾病，包括癌症、神经病变、自身免疫性疾病和造血型疾病‘20川。大量的研究证明，肾脏疾病的发生发展也与P13刚AI(t／mTOR通路有着密切的关联。3．1mTORCl在急性肾损伤中作用缺血再灌注引起肾损伤的完全恢复包括肾形态和功能恢复。急性肾损伤后，肾脏恢复主要通过小管细胞的增殖及损伤的小管上皮细胞的再生【221。雷帕霉素为免疫抑制剂，可以抑制mTOR介导的T细胞增殖和克隆扩增[23】；然而，mTOR是一种普遍存在的激酶，所以雷帕霉素还可以抑制几乎所有细胞类型的增殖，包括肾脏内细胞[24】。有研究证明，在实验性急性肾损伤再生和恢复过程中，mTOR起重要作用。在正常肾组织中mTOR不被激活或着活性很低，但在缺血再灌注损伤后显著增加。所以，使用roTOR抑制剂雷帕霉素会延迟肾损伤修复与肾功能的恢复。雷帕霉素这一作用在于影响了肾小管细胞的增殖，并且诱导其凋亡[24’251。值得注意的是，虽然雷帕霉素会延迟AKI后肾小球滤过率恢复大约2至3天，但即使持续使用雷帕霉素治疗，肾功能最终还是会完全恢复。通过培养肾小管细胞的研究结果表明，肾小管细胞会获得性抵抗雷帕霉素对细胞生长和增殖作用，从而产生这种短暂延迟后完全恢复的现象。生长因子，氨基酸可以激活mTOR，ATPdepletion则起抑制作用。在缺血／再灌注损伤的缺血期，mTOR活性会受到显著抑制，其原因在于这一时期生长因子、氨基酸和细胞ATP的效用会降低；再灌注期间，mTOR会显著活化，其机制尚未阐1j]]E24,25]。我们在大鼠体内的研究结果得到了临床证实。研究表明当肾移植患者使用雷帕霉素可以引起缺血性肾小管损伤，从而导致移植前期肾功能延迟，这是一个重要的临床问题。由于认识到雷帕霉素这一不利影响，临床上会按惯例推迟雷帕霉素给药，直到移植的肾脏功能恢复，或在肾移植和AKI发展阶段暂时停止雷帕霉素的给药[26-30】。103 万方数据山西医科大学博士学位论文3．2mTORCl在糖尿病肾病中作用在美国和西欧糖尿病肾病(DiabeticNephropathy)是引起终末期肾病的首要原因，其形态学改变主要包括肾小球肥大，基底膜增厚，系膜外基质沉积；此外，DN也与肾小管间质损伤，炎症和纤维化进展相关【3l，32J。G／SdelM等人㈣在其研究报道中称，人与小鼠的糖尿病肾病中，mTOR失调会促进肾小球疾病的发展，严格控制mTOR的活性是维持肾小球足细胞功能的关键。基因缺失的复合物1(mTORCl)诱导小鼠足蛋白尿，渐进性肾小球硬化。同时，mTORCl与mTORC2之间关系失衡，也可影响肾小球的病变。Sakaguchi等[341在STZ诱导的早期糖尿病小鼠上发现雷帕霉素不仅抑制了p70S6激酶的磷酸化，而且还可以下调p20和p27的表达，从而抑制了糖尿病小鼠的近端肾小管上皮的肥大。DN中的第一个结构性的变化为肾肿大，是由于现有的肾小球和肾小管细胞肥大，而不是细胞的增殖[32,35]。多项研究表明，mTOR的活化在肾脏及其他器官生理和病理性肥大中起着举足轻重的作用，包括DN典型肾脏肥大【36]。在DN和其他慢性肾损伤疾病中，肾小球肥大的重要致病性在于，它可能会促进足细胞损伤和肾功能的降低，除了引起肾小球肥大外，mTOR的激活可增加基质蛋白的合成，基底膜增厚和DN肾小球系膜外基质沉积等典型的DN病变[37,38]。糖尿病中mTOR的激活至少部分是由于高血糖的影响。高血糖症通过Akt激活和AMPK抑制的联合作用增加了mTOR活性【39’401。mTOR介导DN肾脏损伤作用的重要性，已在糖尿病肾病大鼠模型(链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠)体内实验中得到证明。在这种DN模型中，肾脏的mTOR早期被活化，雷帕霉素不仅可以减少mTOR激活，而且可以减轻DN中肾小球典型的病理改变，包括肥大，基底膜增厚，和系膜基质沉积；重要的是，雷帕霉素的这些作用也与蛋白尿的减少相关【41’421。在DN中雷帕霉素显著抑制炎性细胞主要是淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，这种作用可能在于雷帕霉素能抑制B和T淋巴细胞增殖和克隆扩增。同时雷帕霉 万方数据山西医科大学博士学位论文素也可以改善的肾脏内促炎细胞因子和趋化因子，如单核细胞趋化蛋白、RANTES、IL．8和fractaline，这些因子会加剧DN中的炎症反应[41，421。肾间质纤维化是DN的另一重要特征，mTOR在DN和其他形式CKD的促纤维化作用的具体机制及调控途径还没有被完全阐明。大量的研究结果显示，可能存在以下几种机i书lJ．(1)mTOR能刺激成纤维细胞增殖和促进胶原纤维的生成【43，44J；(2)mTOR增加促纤维化细胞因子的释放，例如TGF．B1和结缔组织生长因子，这些细胞因子在肾小管间质纤维化中发挥重要作用‘41，42】；(3)mTOR可能与上皮细胞转分化(EMT)相关，EMT是肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞，这些成纤维细胞通过肾小管基底膜并进入间质，研究表明在DN和其他形式CKD的动物模型中，mTOR能促进EMT，从而引起肾间质纤维化[45,46]。3．3mTOR和常染色体显性多囊肾病常染色体显性多囊肾病(ADPI①)是一种遗传性疾病，主要表现为双肾皮、髓质中多个液性囊肿形成与增大，伴肾功能逐渐下降，可呈多系统受累。随着病程进展，囊肿可压迫、取代周围正常肾组织，非囊肿组织逐渐出现缺血、硬化和／或纤维化，功能肾单位进行性丧失引发残存肾单位的高灌注、高滤过，最终导致患者发生终末期肾功能衰竭【47|。定位于16号染色体短臂1区3带3亚带(16P13．3)的PKDl基因、定位于4号常染色体常臂2区2带(4q22)的PKD2基因的突变，分别编码蛋白PCI、PC2异常改变被认为是产生ADPKD的主要原因【481。实验研究发现，囊肿的形成及进展具有特异性的病理生理过程，上皮细胞增殖和凋亡异常，细胞极性改变和分化不良，液体分泌增加，细胞外基质重塑及间质纤维化【491。埃德尔斯坦和他的同事是最初研究mTOR在ADPKD发病机制中作用的，研究结果显示，在多囊肾Han：SPRD大鼠模型中雷帕霉素延缓囊肿形成【5们，这一结果被其他研究所在同一模型中得到了证明。随后，Shillingfordetal【5l】提供了大量证据证明mTOR会促进人类多囊肾病的发生。研究显示，PCI与mTOR在胞质区相互作用，并抑制mTOR，在小鼠和人ADPKD中PCI功能的缺失可以 万方数据山西医科大学博士学位论文引起上皮细胞内mTOR显著活化，同时他们发现mTOR抑制雷帕霉素不仅减缓PKD小鼠模型囊肿增大，而且减缓接受肾移植ADPKD患者的肾脏的肿大。NovalicZ等人【521在动物模型中发现，mTOR抑制剂对多囊肾有益。在研究中采用高低两个剂量的西罗莫司分别作用在两个PKDl突变小鼠模型的不同阶段。高剂量治疗疾病的早期，可减少肾组织中mTOR的信号，抑制囊肿生成，加速囊肿回归的，并减少纤维化及免疫细胞的浸润，相比之下，低剂量治疗没有显着效果。且mTOR的活性水平与肾囊肿型的严重程度密切相关。这些结果使人们更关注于雷帕霉素临床上治疗ADPKD的研究，目前三个临床试验正在进行中【53】o3．4mTOR和肾细胞癌肾细胞癌(renalcellcarcinoma，I配C)，起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞，占的成人恶性肿瘤的2-3％，具有不同的病理类型。其发病原因虽然还不十分明确，但主要与环境因素和基因的内在因素相关，最近的基因学研究发现了家族性。肾细胞癌中那些可以导致肿瘤形成的基因：如抑癌基因VHL、TSC和癌基因MET、FH等。大约三分之一的肾癌患者肿瘤局限于肾脏可以手术治疗，然而由于缺少早期警示约30％肾癌患者已有转移或者在随访阶段出现转移。RCC对放和化疗均不敏感，以及对新型靶向治疗和免疫治疗有一定反应[54,55]。mTOR在RCC的发病机制中起关键作用。首先，mTORCl持续性激活促进细胞生长和大量增殖；此外，mTORCl可以增加细胞水平的HIF．1a，进而刺激产生VEGF、PDGF和TNF．a等血管生成因子，血管生成能满足肿瘤生长所必须的日益增长的氧气需求，从而加速肿瘤生长[56,57]；最后，基因突变可导致mTOR活性增加引起转移性肾细胞癌的发病率提高，例如，在约5％的肾癌患者中发现PTEN功能丧失，PTEN通过P13K／Akt途径负调节mTOR的活化【58]；另外，在结节硬化的患者中，基因TSCl或TSC2突变丧失功能，从而引起TSC失活，影响mTOR活化的负调控【59l。mTOR抑制剂依维莫司和西罗莫司在临床实验已用于晚期肾细胞癌的治 万方数据山西医科大学博士学位论文疗，并显示出强大的潜力【601。但临床上发现其治疗效果只对一部分人敏感，而一部分人会出现耐药的问题，其具体机制尚不清楚，可能与反馈性激活Akt通路有关[61,621。结论大量的研究已经认识到的mTOR在许多肾脏疾病发展中起重要作用。mTOR的活化在介导AKI后肾功能恢复和修复中起重要作用，抑制mTOR会延迟肾功能恢复；而其在许多其他肾脏疾病的活化已被证明是有害的。mTOR活化可加重糖尿病和慢性肾脏疾病的进展，另外，mTOR在ADPKD过度激活可增加囊肿的形成和促进肾衰竭；mTOR是在某些肾癌患者中也是重要致病因素。这些认识为人们治疗肾脏疾病提供新的思路。雷帕霉素在肾移植患者已使用多年，最近，雷帕霉素类似物，开始尝试用于治疗转移性肾细胞癌；mTOR抑制剂在ADPKD患者的潜在治疗作用正在评估和进行临床试验；是否mTOR抑制剂可以用于治疗DN肾功能衰竭和其他形式的慢性肾病当前尚无定论，还需要进行临床研究。 万方数据山西医科大学博士学位论文参考文献：[1】．Brunskill，N．J．，Rapamycin：anewstringtotheantiproteinuricbow7．JAmSocNephrol，2005．16(7)：P．1878-9．[2]．SarbassovDD，AliSM，SabatiniDM．GrowingrolesforthemTORpathway．CurrOpinCellBiol2005，17：596--603．[3】．HayN，SonenbergN．Upstreamanddown·streamofmTOR．GenesDev．2004；18：1926_1945．[4】．LoewithRJacintoE，WullschlegerD．TwoTORcomplexes，onlyoneofwhichisrapamycinsenskive，havedistinctrolesincellgrowthcontr01．MolCell．2002；10(3)：457-468．[5]．RichterJD，SonenbergN．Regulationofcap-dependenttranslationbyelF4Einhibitoryproteins．Nature．2005；433：477-480．[6]．HannanKM，BrandenburgerYJenkins．AmTOR-dependentregulationofribosomalgenetranscriptionrequiresS6K1andismediatedbyphosphorylationofthecarboxy-terminalactivationdomainofthenucleolartranscriptionfactorUBEMolCellBi01．2003；23：8862-8877．[7】．PengT，GolubTR，SabatiniDM．Theimmunosuppressantrapamycinmimicsastarvation-likesignaldistinctfromaminoacidandglucosedeprivation．MolCellBi01．2002；22：5575-5584．[8]．MeijerAJ，CodognoP．Regulationandroleofautophagyinmammaliancells．IntJBiochenCellBi01．2004；36：2445-2462。[9】．SarbassovDD，AliSM，KimDH．Rictor,anovelbindingpartnerofmTOR，definesarapamycin-insensitiveandraptor-independentpathwaythatregulatesthecytoskeleton．CurrBi01．2004；14：1296-1302．[10]。JacintoE，LoewithRSchmidtA．MammalianTORcomplex2controlstheactincytoskeletonandisrapamycininsensitive．NatCellBi01．2004；6：1122—1128．108 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万方数据山西医科大学博士学位论文【221．BonventreIV．Dedifferentiationandproliferationofsurvivingepithelialcellsinacuterenalfailure．JAmSocNephrol2003：14：$55-$61．[23】．CamardoJ．Therapamuneeraofimmunosuppression2003：Thejoumeyfromthelaboratorytoclinicaltransplantation．TransplantProc2003：35：18S-24S．[241．LieberthalWFuhroR，AndryCC，RennkeH，AbemathyVE，KohJS，ValeriR，LevineJS．Rapamycinimpairsrecoveryfromacuterenalfailure：Roleofcell-cyclearrestandapoptosisoftubularcells．AmJPhysiolRenalPhysiol2001：281：F693-F706，[251．LieberthalWFuhroR，AndryC，PatelLevineJS．Rapamycindelaysbutdoesnotpreventrecoveryfromacuterenalfailure：Roleofacquiredtubularresistance．Transplantation2006：82：17-122．【261．SmithKD，WrenshallLE，NicosiaRF，PichlerR，MarshCL，AlpersCE，PolissarN，DavisCL．Delayedgraftfunctionandcastnephropathyassociatedwithtacrolimusplusrapamycinuse．JAmSocNephrol2003：14：1037-1045．[27]．McTaggartRA，GottliebD，BrooksJ，Bacchetti只Roberts毋TomlanovichS，FengS：Sirolimusprolongsrecoveryfromdelayedgraftfunctionaftercadavericrenaltransplantation．AmJTransplant2003：3：41每423．【281．FullerTF,FreiseCE，SerkovaN，NiemannCU，Olson儿，FengS．Sirolimusdelaysrecoveryofratkidneytransplantsafterischemia—reperfusion蝎ury．Transplantation2003：76：1594-1599．[29]．GoncalvesGM，CenedezeMA，FeitozaCQ，dePaulaCB，MarquesGD，PinheiroHS，dePaulaAntunesTeixeiraVAntoniadosReisM，Pacheco—SilvaA，CamaraNO．Theroleofimmunosuppressivedrugsinaggravatingrenalischemiaandreperfusioninjury．TransplantProc2007：39：417-420．[30]。LoverreA，DitonnoP，CrovaceAGesualdoL，RanieriE，PontrelliP，StalloneGInfanteB，SchenaA，DiPaoloS，CapobiancoC，UrsiM，PalazzoS，BattagliaM，110 万方数据山西医科大学博士学位论文SelvaggiFP,SchenaFP,GrandalianoGIschemia—reperfusioninducesglomerularandtubularactivationofproinflammatoryandantiapoptoticpathways：Differentialmodulationbyrapamycin．JAmSocNephrol2004：15：2675-2686．[31]．EstacioRO，SchrierRW：Diabeticnephropathy：Pathogenesis，diagnosis，andpreventionofprogression．AdvInternMed2001：46：359—408．【32]．MolitchME，DeFronzoRA，FranzMJ，KeaneWF，MogensenCE，ParvingHH，SteffesMWoNephropathyindiabetes．DiabetesCare272004：Suppl1：$79一$83．[331．G6delM，HartlebenB，HerbachN．RoleofmTORinpodocytefunctionanddiabeticnephropathyinhumansandmice．JClinInvest．2011；121(6)：2197—2209．[34]．SakaguchiM，IsonoM，IsshikiK．InhibitionofmTORsignalingwithrapamycinattenuatesrenalhypertrophyintheearlydiabeticmice．BiochemBiophysResCommun．2006；340(1)：296·301．[35]．HostetterTH：Hyperfikrationandglomerulosclerosis．SeminNephrol2003：23：194一199．【36]．ChenJK，ChenJ，NeilsonEGHarrisRC．Roleofmammaliantargetofrapamycinsignalingincompensatoryrenalhypertrophy．JAmSocNephrol2005：16：1384-1391【37]．KasinathBS，MariappanMM，SataranatarajanK，LeeMJ，FeliersD：mRNAtranslation．Unexploredterritoryinrenalscience．JAmSocNephrol2006：17：3281-3292．[38]．MariappanMM，FeliersD，MummidiS，ChoudhuryGGKasinathBS：Highglucose，highinsulin，andtheircombinationrapidlyinducelaminin—betalsynthesisbyregulationofmRNAtranslationinrenalepithelialcells．Diabetes2007：56：476—485．[39]．FraenkelM，Ketzinel-GiladM，AriavYPappoO，KaracaM，CastelJ，Berthauk 万方数据山西医科大学博士学位论文陋MagnanC，CerasiE，KaiserN，LeibowitzGmTORinhibitionbyrapamycinpreventsbeta-celladaptationtohyperglycemiaandexacerbatesthemetabolicstateintype2diabetes．Diabetes2008：57：945-957．【40]．LeeMJ，FeliersD，MariappanMM，SataranatarajanK，MahimainathanL，MusiN，ForetzM，ViolletB，WeinbergJM，ChoudhuryGGKasinathBS：AroleforAMP。activatedproteinkinaseindiabetesinducedrenalhypertrophy．AmJPhysiolRenalPhysiol2007：292：F617-F627．[41]．YangYWangJ，QinL，ShouZ，ZhaoJ，WangH，ChenYChenJ．Rapamycinpreventsearlystepsofthedevelopmentofdiabeticnephropathyinrats．AmJNephrol2007：27：495-502．【42]．LloberasN，CruzadoJM，FranquesaM，Herrero-FresnedaI，TorrasJ，AlperovichGRamaI，VidalA，GrinyoJM：Mammaliantargetofrapamycinpathwayblockadeslowsprogressionofdiabetickidneydiseaseinrats．JAmSocNephrol2006：17：1395-1404，[43]．LockHR，SacksSH，RobsonMG：Rapamycinatsubimmunosuppressivelevelsinhibitsmesangialcellproliferationandextracellularmatrixproduction．AmJPhysioIRenalPhysiol2007：292：F76_F81，【44】．ShegogueD，TrojanowskaM：MammaliantargetofrapamycinpositivelyregulatescollagentypeIproductionviaaphosphatidylinositol3-kinase—independentpathway．JBiolChem279：23166—23175，2004[451．LiuYEpithelialtomesenchymaltransitioninrenalfibrogenesis：Pathologicsignificance，molecularmechanism，andtherapeuticintervention．JAmSocNephrol2004：15：1-12．[46]．LamouilleS，DerynckR：CellsizeandinvasioninTGF．beta．inducedepithelialtomesenchymaltransitionisregulatedbyactivationofthemTORpathway．JCellBi012007：178：437L451．112 万方数据山西医科大学博士学位论文[47]．WilsonPD．Polycystickidneydisease．NEnglJMed2004：350：151—164．[48】．Igarashi只SomloS：Geneticsandpathogenesisofpolycystickidneydisease．JAmSocNephrol2002：13：2384-2398．[49]．AguiariGTrimiVBogoM，MangoliniA，SzabadkaiGPintonP，Witzgall凡HarrisPC，BoreaPA，RizzutoRdelSennoL．Novelroleforpolycystin．1inmodulatingcellproliferationthroughcalciumoscillationsinkidneycells．CellProlif2008：41：554-573．【50]．TaoY，KimJ，SchrierRW,EdelsteinCL．Rapamycinmarkedlyslowsdiseaseprogressioninaratmodelofpolycysticdisease．JAmSocNephrol2005：16：46—51．[51]．ShillingfordJM，MurciaNS，LarsonCH，LowSH，HedgepethR，BrownN，FlaskCA，NovickAC，GoldfarbDA，Kramer—ZuckerA，Walz13lPiontekKB，GerminoGljIWeimbsT：ThemTORpathwayisregulatedbypolycystin-1，anditsinhibitionreversesrenalcystogenesisinpolycystickidneydisease．ProcNatlAcadSciUSA2006：103：5466-5471．[52]．NovalicZ，vanderWalAM，LeonhardWN．Dose-DependentEffectsofSirolimusonmTORSignalingandPolycysticKidneyDisease．JAmSocNephr01．2012Feb16．[53]．TorraR．Newtherapeuticprospectsinautosomaldominantpolycystickidneydisease．Nefrologia2008：28：257-262．[54]．ClarkPE．Recentadvancesintargetedtherapyforrenalcellcarcinoma．CurrOpinUr012007：17：331-336．[55]．PrenenH，GilT，AwadaA．Newtherapeuticdevelopmentsinrenalcellcancer．CritRev0ncolHematol2009：69：56—63．[56]．GarciaJA，DanielpourD．Mammaliantargetofrapamycininhibitionasatherapeuticstrategyinthemanagementofurologicmalignancies．MolCancerTher113 万方数据山西医科大学博士学位论文2008：7：1347-1354．[57]．HudsonCC，LiuM，Chiang∞OttemessDM，LoomisDC，KaperF，GiacciaAJ，AbrahamRT．Regulationofhypoxia·induciblefactorlalphaexpressionandfunctionbythemammaliantargetofrapamycin．MolCellBiol2002：22：7004_7014．[58]．KondoK，YaoM，KobayashiK，OtaS，YoshidaM，KanekoS，BabaM，SakaiN，KishidaeKawakamiS，Uemura／-I,Nagashima巧Nakatani巧HosakaM．PTEN／MMACl／TEPlmutationsinhumanprimaryrenal．cellcarcinomasandrenalcarcinomaeelllines．IntJCancer2001：91：219-224．[59]．BrugarolasJB，VazquezF，ReddyA，SellersWR，KaelinWGJr：TSC2regulatesVEGFthroughmTOR-dependentand-independentpathways．CancerCell2003：4：147-158．[60]．BattelliC，ChoDC．mTORinhibitorsinrenalcellcarcinoma．Therapv．2011；8(4)：359-367．[61]．PalSK，WilliamsS，JosephsonDY．NovelTherapiesforMetastaticRenalCellCarcinoma：EffortstoExpandbeyondtheVEGF／mTORSignalingParadigm．MolCancerTher．2012Mar；11(3)：526．37．【62]·ElfikyAA，AzizSA，ConradPJ．Characterizationandtargetingofphosphatidylinositol-3kinase(P13K)andmammaliantargetofrapamycin(mTOR)inrenalcellcancer．JTranslMed．2011；11(9)：133．137．114 万方数据山西医科大学博士学位论文姓名：职称：最后学历：田继华讲师硕士研究生学习工作经历1995．09—1998．071999．09—2002．072003．09—2006．072006．07一至今2010．09一至今个人简介性别：女籍贯：河北省曲阳县毕业院校：山西医科大学山西医科大学临床专科山西医科大学专升本攻读学士学位山西医科大学第一临床医院攻读硕士学位山西医科大学微生物学与免疫学教研室工作山西医科大学附属人民医院攻读博士学位在读期间发表的文章1．TianJ，WangY，ZhouX，LiY，WangC，LiJ，LiR·．RapamycinSlowsIgANephropathyProgressionintheRat．AmJNephr01．2014Mar6；39(3)：218-229．2．YanhongWang，RongshanLi幸，XiQiao，JihuaTian，XiaoleSu，RuipingWu，RuijingZhang，XiaoshuangZhou，JiamingLi，ShanShao．Intermedinprotectsagainsttubularcellhypoxia-reoxygenationmjuryinvitrobypromotingcellproliferationandup-regulatingcyclinD1expression．Nephrology．2013；18(9)：623—32．3．王艳红，田继华，郭海秀，米洋，李佳明，李荣山．脂联素对高糖环境下足细胞内质网应激和细胞骨架的影响．中华医学杂志，2014，94(15)：1092-96在读期间参与研究的科研项目国家自然基金(30771004)：Intermedin对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用115 万方数据山西医科大学博士学位论文及机制研究．山西省研究生优秀创新项目(20113071)：雷帕霉素与他克莫司对IgA肾病大鼠的作用及其机制山西省科技攻关项目(20120313021．1)：周期联合免疫抑制剂对阿霉素肾病大鼠治疗作用及其机制的研究山西医科大学基础医学院331基金项目(201239)：P13K／Al(t／mTOR信号通路在IgA肾病发病中的作用及靶向干预研究116 万方数据山西医科大学博士学位论文攻读学位期间发表论文情况序论文题目作者刊物名称，年，卷收录号(期)：起止页码情况RapamycinSlowsIgANephropathyTianJ，WangY，ZhouX，LiAmJNcphr01．12014Mar6；SCIProgressionintheRat．Y，WangC，LiJ，LiR木39(3)：218—229IntermedinprotectsagainsttubulaYanhongWang,Rongshancellhypoxia-reoxygenationinjuryinLi车，XiQiao，JihuaTian，Ncphrology．SCI2vi缸'obypromotingcellproliferationXiaoleSu,RuipingWu,2013；18(9)：623-32andup-regulatingcycl／nD1RuijingZhang，Xiaoshuangexpression．Zhou,JiamingLi，ShanShao注：1．仅需填写与学位论文内容相关者，论文需已发表或已被接收：2．“作者”一栏需按顺序列出论文的所有作者3．期刊“年，卷(期)，起止页码”栏：(1)如果论文已发表，请填写发表的年，卷(期)，起止页码；(2)如果论文已被接受，填写将要发表的年，卷(期)、；4．收录情况：论文如被SCI或EI等收录，则填写“SCI”或“EF’117 万方数据山西医科大学博士学位论文致谢岁月荏苒，光阴飞逝，好像一切才刚刚开始，四年的时间却转瞬即逝，在这一千余个日日夜夜，是恩师的关心和勉励，家人、同事、亲朋好友们的关怀与支持，使自己能够在这条充满了艰辛的求学之路上克服重重困难，坚定而自信地走下去。感谢恩师李荣山教授四年来对我的严格教诲和精心指导，导师严谨的治学态度、敏锐的科研思维、达观的人生境界、对工作的精益求精和实事求是我学习的楷模。本课题进行中遇到的每一次挫折，导师都给予了关键性的帮助；所取得的每一点进步，都离不开导师的指导；李老师为我们尽可能地提供完善、自主、愉快的学习科研环境，使我们能专注于实验研究。从导师身上我学到了如何做人以及如何做事的原则，它将指导我今后的人生道路，是我生命中最宝贵的财富!衷心感谢肾内科王利华老师、乔唏老师及全体医护人员四年来对我的关心爱护、支持和帮助。感谢王晨老师，张晓琴老师等病理科老师在病理切片，组化染色及病理片分析给予的指导和帮助。衷心感谢山西医科大学微生物学与免疫学教研室王桂琴主任及全体教师四年中对我的帮助与支持，使我能够在工作的同时，有大量时间来完成我的实验。衷心感谢四年来和我朝夕相处的师姐王艳红博士、师妹李艳娇博士、周晓霜博士、李佳明硕士等，与你们亲密的同学之情为今后的人生积累了更多财富。感谢师姐王艳红博士在实验操作、实施及论文撰写、投稿方面给予的倾力帮助与支持，使得本实验能够按照计划顺利进行；感谢师妹在学习、生活过程中给予我的关心和爱护，我们互相鼓励、共同探讨实验中经验、教训，使我受益菲浅。衷心感谢山西医科大学2010级博士班所有同学，四年的共同成长，你们的友谊是将我最大的财富。特别感谢我的父母、我爱人及我的儿子，这四年来，我的父母给予了我最无私的爱，照顾我的儿子，没有让我因为孩子而耽误学业，在我最困难和迷茫 万方数据山西医科大学博士学位论文的时候给我以信心和勇气，默默地支持我完成学业。感谢我的亲人多年来给予我的理解，支持，鼓励和爱护，你们是我最坚强的后盾、避风的港湾和前进的动力，在此我祝愿你们能永远健康、幸福!曾对我帮助过而文中未提及的朋友，不是因为你们的帮助微不足道，而是由于时间仓促，难免挂一漏万。再次感谢对我帮助过的各位老师、同学、亲人和朋友。
