家蚕v-atpase+b亚基和6pgl基因的研究

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1、江苏大学硕士学位论文摘要蚕是重要的经济昆虫，蚕丝业是我国拥有5000多年悠久历史的传统产业，从古至今在社会经济文化生活中占有重要地位，同时家蚕也是鳞翅目的模式昆虫。家蚕功能基因组学的研究将为全面、准确的了解家蚕生物性状的遗传基础和分子调控机制，为改善蚕丝产业提供了理论基础和技术支持，也为解明基础生物学现象提供了基础。本论文课题通过利用实验和生物信息学相结合的方法克隆得到了家蚕二个新基因，并对这些基因做了初步的结构和功能分析。主要研究结论如下：(1)利用电子克隆方法得到了家蚕V一√mase的B亚基，该基因在多种生

2、物体中都非常保守。I汀一PCR结果显示该基因在各组织中都有表达。对家蚕抗性品系NB和感性品系306接种曰mNPV病毒后，分别在24h，48h和72h提取家蚕中肠砒峪，并利用荧光定量PCR(qPCR)分析果表明：感染后24h该基因在抗性品系中比感性品系中表达水平高，这可能跟V．ATPase参与抗BmNPV有关。在感染后48h和72h，V．ATPase的表达水平降低到一个很低水平。利用pET．30表达系统，在大肠杆菌中表达了该基因，得到了分子量约60kD的融合蛋白，制备了抗血清。对家蚕中肠的免疫组化结果显示，V—A

3、TPase主要定位在中肠杯状细胞的顶端质膜，以及顶端质膜形成的空洞周围。(2)利用电子克隆方法得到了家蚕6一磷酸葡萄糖酸内酯酶T江苏大学硕士学位论文(6一Phospho哲uconol拟onase，6PGL)基因。生物信息学分析结果表明：该基因含有四个外显子和三个内含子，开放阅读框(Ol④长702bp，编码233个氨基酸，相对分子质量约为26kD，等电点为5．41，并且具有保守的6．磷酸葡萄糖酸内酯酶结构域，在家蚕基因组中为单拷贝基因。克隆测序结果与预期一致，序列提交NCBI库(Ge出ankno：EFl9810钔

4、。设计引物扩增出了其编码序列，大肠杆菌表达得到了分子量约30kD的融合蛋白。关键词：家蚕，中肠，6PGL，V-ATPase，ImPCR，荧光定量PCR，免疫组化，W，estemblotⅡ江苏大学硕士学位论文Silkwonn，曰铡参p珑D啊isallimportanteconoInicinsectandthemodelinsectofLepi(10ptera．SnkiIldus姆hasdevelopedformorethan5000yearsinChiIla，andmakea伊eatcontributiontot

5、heli：feaIldeconomyofC衄la．Silkwo吼genomewassequencedbythewhole—genomeshotg吼Inethod，andreleasedtoGenBanki11theOctoberof2003．眦sisasi鲥fic枷deVelopmentofsilkwoHIlresearch，andlaythefo吼dationforthes砌yoffunctionalgenesofsm滞orrll．UsiIlgthemethodcomprisedexpe抽entandbioi

6、IlfomaticsappToaches，weCloned锕onovelgenesofB．mDrf，andmadesomebasicala11alysisofthesegenesintmsresearch．TheresearchprocessandthemainConclllsionsarepresentasfollows：(1)usi】略thei11silicodoningmethod，wedonedtheV-ArPaseBSubuIlit，t11isgenewasaweⅡConseⅣedproteiniIl

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8、48and72hanerB历NPVi血dion．nemaIltitativereal·timePCRresultshowsthatat24hp．i．expressionleVelofV二ArPase—BiIltheresistantstrainwasmuchhigherthaninthesusceptiblestrain．T11ismayiIldicatethatV-ArPasepla