诱导多能干细胞向生殖细胞分化的实验研究

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1、博士学位论文诱导多能干细胞向生殖细胞分化的实验研究DERIVATIONOFGERMCELLSFROMINl3UCEDPLURIPOTENTSTEMCELLS姓名：学号：指导教师：申请学位：学科专业：研究方向：培养单位：基金资助：蔡恒0087109023徐晨教授博士人体解剖与组织胚胎学生殖生物学基础医学院国家重点基础研究发展计划(2010CB945201)2012年5月上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发

2、表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：蒋恒日期：刀，)年，月7日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于

3、不保密倒。(请在以上方

4、框内打“√”)学位论文作者签名：搽恒指导教师签名：日期：夕f声年上月7日日期：2口，2年岁月矿日诱导多能干细胞向生殖细胞分化的实验研究摘要近年来，在世界范围内，男性精子的数量和质量呈下降趋势，男性不育症的发病率在逐年上升，其中约50％是由于生精障碍所致。干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，是生命科学领域的研究热点之一。自2006年，来源于体细胞的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS细胞)诞生以来，由于iPS细胞具有与胚胎干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)相似的特性，且来源广泛、

5、取材方便，可以获得疾病或患者特异性的iPS细胞，且不涉及免疫排斥、医学伦理学等问题，具有ES细胞所不能比拟的优势，因而受到了广泛关注。目前，ES细胞向生殖细胞分化的研究已经取得了一定的成果，而iPS细胞定向诱导分化的研究较少。在本研究中，我们通过体内、体外两种途径诱导iPS细胞分化，探讨其向生殖细胞分化的潜能，希望为研究生殖细胞的发育提供实验依据，为研究不育症的发病机制及细胞替代性治疗提供新思路。在体实验中，我们先后将新生小鼠睾丸组织、睾丸细胞移植至裸鼠背部皮下组织，发现睾丸组织可在异位完成精子发生过程，移植的睾丸细胞可定植、聚集，形成管状结

6、构，观察到了精原细胞在管中的迁移和增殖，新生小鼠睾丸细胞在皮下重构形成了生精小管样结构，从而说明裸鼠皮下组织可以提供精子发生的微环境。在此基础上，我们将小鼠EGPF．iPS4．1细胞与新生小鼠睾丸细胞共同移植至裸鼠皮下，探讨iPS细胞向生殖细胞的分化潜能。在移植物中可以检测到EGFP．iPS4．1来源的、表达生殖细胞特异性标志物的细胞，表明iPS细胞可在此微环境下向生殖细胞分化。在体外培养体系中，我们在形成类胚体(EB)的基础上，以维甲酸(RA)等作为诱导分化因子，通过形态学观察、RT．PCR、流式细胞分析术、免疫荧光等检测方法研究EGFP．

7、iPS4．1细胞在体外向生殖细胞分化的潜能。RT．PCR结果显示，iPS细胞在形成EB的过程中表达一系列雄性生殖系的标志性基因。流式细胞分析术的结果显示，在EB中存在SSEA．1+／integrin．133+的一类细胞，可认为是原始生殖细胞。我们将这一类细胞在含有RA的条件培养基中培养，逐渐有细胞克隆形成，并可扩增传代。此类细胞克隆呈碱性磷酸酶阳性，表达干细胞多能性标志蛋I刍Oct4和生殖细胞特异性标志蛋白MVH，说明其为生殖干细胞。综上，我们的研究表明，EGFP．iPS4．1细胞具有与ES细胞相似的特性，可以在体内、体外诱导条件下向生殖细胞

8、分化。关键词诱导多能干细胞精子发生诱导分化微环境生精小管异位重构生殖干细胞DERlV『ATIONOFGERMCELLSFROMINDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLSABSTRACTInrecentyears，theincidencerateofmaleinfertilityhasbeenincreasingallovertheworld，about50％ofwhichiscausedbyspermatogenesisdysfunction．Basedonitsself-renewalpropertyandmultilineag

9、epotentials，stemcellbecameaverypowerfultechniqueforregenerativemedicine，andaresear