干扰fzd1逆转wntβ-catenin通路介导的乳腺癌细胞多药耐药的研究

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1、山东大学博士学位论文干扰FZD1逆转Wnt/β--catenin通路介导的乳腺癌细胞多药耐药的研究姓名：张慧申请学位级别：博士专业：病理学与病理生理学指导教师：周庚寅2012-11-15山东大学博士学位论文干扰FZDl逆转Wnt／13-catenin通路介导的乳腺癌细胞多药耐药的研究研究生张慧导师周庚寅教授专业病理学与病理生理学中文摘要【研究背景】乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，且发病率仍在不断升高，严重危害世界女性健康。作为对化疗比较敏感的实体瘤之一，化疗是其不可替代的治疗手段，然而乳腺癌多药耐药的出现成为导致乳腺癌化

2、疗失败的重要原因。多药耐药也称交叉耐药，即肿瘤对一系列结构、靶点和作用机制不同的药物均产生耐药性，其发生涉及多重机制。MDRl基因编码的P．糖蛋白(MDRl／P-gP)，作为ATP结合盒膜转运蛋白超家族的成员，可通过水解ATP获得能量将进入细胞内的药物泵出，降低药物的浓度及毒性，介导多种肿瘤的多药耐药。P．糖蛋白介导的多药耐药约占乳腺癌多药耐药的55％，因此对MDRl／P—gP进行干预成为逆转乳腺癌的化疗耐药的重要途径。尽管已开发了多种针对MDRl／P．gP的抑制剂及调节剂，但治疗浓度的毒性及副作用限制了其应用：免疫学

3、治疗、中药等天然药物治疗以及基因治疗也未能完全逆转耐药。近年的临床前研究中基于调控P．糖蛋白转录的信号通路的分子靶向治疗崭露头角。Yamada等在结肠癌中的研究表明，人类MDRl基因启动子区包含多个Tcf4／LEF结合基序，MDRl是B．catenin／Tcf4／LEF转录复合物的直接靶基因，抑制WnVp—catenin信号传导通路可下调MDRl的表达。Wnt／13．catenin信号通路对多种肿瘤发生发展均起重要调控作用，其中包括乳腺癌。13-catenin蛋白是通路的核心，Wnt信号蛋白与膜表面的Frizzled受

4、体结合使通路活化，大量13．catenin进入细胞核内，与TCF／LEF结合形成13．catenill／TCF／LEF转录复合物，从而调节下游靶基因的转录。研究者已发现Wnt蛋白的受体Frizzled(FZD)1／2在乳腺浸润性导管癌中过表达，作为Wnt／13．catenin通路必不可少的组成元件，其表达的改变可影响通路的调控。近年有报道证实，FZDl在神经母细胞瘤中可通过激活W州B．catenin信号l山东大学博士学位论文通路调控MDRl的表达影响神经母细胞瘤化疗耐药。我们检测了FZDl在乳腺癌敏感细胞MCF．7和M

5、DA．MB．231以及多药耐药细胞MCF．7／ADM中的表达，发现其在多药耐药的ADM细胞中无论mRNA水平还是蛋白水平均显著高于敏感株。对敏感株给予不同浓度阿霉素进行诱导，72h后检测FZDl及MDRlmRNA水平的表达，发现在低至中浓度阿霉素诱导下二者均明显升高，提示FZDl及Wnt／p．catenin通路在乳腺癌细胞获得性多药耐药的发生发展中的潜在作用。因此在本研究中我们设计小干扰RNA(siRNA)载体转染乳腺癌耐药细胞后沉默FZDl以期下调MDRI／P．gP的表达、逆转多药耐药性并探讨Wnt／p．cateni

6、n通路在其中的调控作用。【研究方法】1．分别用RT．PCR及Westernblot方法检测实验室培养的3种乳腺癌细胞系MCF．7、MDA．MB．231以及多药耐药细胞MCF．7／ADM中FZDl及MDRl基因的表达情况。并分别将敏感细胞MCF．7、MDA．MB一23l转染含MDRl全长eDNA序列的载体SF91m3PRE以获得耐药细胞MCF．7／MDR、MDA．MB．231／MDR。2．敏感细胞MCF一7及MDA．MB．231分别给予浓度为0,0．2，l，5pM的阿霉素作用72h后提取细胞总IⅢA进行实时荧光定量PCR

7、检测FZDl及MDRlmRNA水平表达的改变。3．分别设计并合成针对FZDl基因的双链干扰RNA序列以及作为对照的非靶向性干扰序列，将其定向插入到质粒载体pSUPER．neo+GFP中，构建稳定表达载体pSUPER-siFZDl和pSUPER-siNotarget。酶切及测序鉴定正确后，大量扩增。4．上述干扰质粒载体分别转染3种多药耐药细胞中，培养48h后，通过RT．PCR检测各组细胞中FZDlmRNA和MDRlmRNA的表达情况，应用Westernblot检测FZDl蛋白和P．糖蛋白表达情况，应用罗丹明外排实验流式细

8、胞术检NP．糖蛋白外排功能，应用MTT法检测各组细胞对阿霉素、紫杉醇、5．氟尿嘧啶和顺铂的半数细胞抑制浓度(ic50)及相对耐药指数(I水)的改变，评价FZDl干扰对细胞多药耐药性的影响。分别提取细胞浆蛋白及核蛋白，应用Westernblot方法检测胞浆及胞核中p．catenin蛋白的表达情况，揭示Wnt／13．catenin通路