microrna介导wnt通路抑制a肺癌细胞球增殖能力的研究

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1、分类号：密级：UDC：学号：T1041120101048南昌大学医学院博士研究生学位论文microRNA介导Wnt通路抑制A549肺癌细胞球增殖能力的研究ThestudyofmicroRNAmediatedWntsignalingpathwaytoregulatetheproliferationofA549spheres胡欣春培养单位（院、系）：南昌大学第二附属医院指导教师姓名、职称：徐建军教授主任医师申请学位的学科门类：临床医学学科专业名称：外科学（心胸外科）论文答辩日期：2014年6月7日答辩委员会主席：评阅人：2014年6月I学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进

2、行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中

3、国科学技术信息研究所和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日I摘要目前在世界范围内，肺癌是威胁公共健康的主要原因之一。研究发现肺癌高死亡率主要是化疗仅能杀灭对化疗药物敏感的肿瘤细胞，而无法有效杀灭天然耐药或通过突变获得耐药能力的一类亚群肿瘤细胞,使得肿瘤出现复发和耐药，最终导致治疗的失败。近年来的研究证实这一类亚群肿瘤细胞不仅具有耐药的能力，还具有自我更新、再生

4、等干细胞特性，故被称为肿瘤干/祖细胞（cancerstem/initiatingcell）。目前寻找基因靶点，有效杀灭肿瘤干细胞已成为肿瘤治疗的主要关注点之一。microRNAs(miRNAs)是一种内源性的、含有18-25个核苷酸的单链非编码RNA，其主要通过与特定靶mRNA的3’端UTR的互补（包括完全性和非完全性），抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的降解，从而发挥调控作用。由于其具有一个miRNA可作用于多个靶点的独特作用，因此通常miRNA影响靶点的表达以及靶点相关的信号通路使其发挥的效应进一步放大。目前研究发现miRNA在维持细胞正常机能方面发挥着重要的作用，当miRNA的表达或

5、结构发生异常时，可导致肿瘤的发生。Wnt家族蛋白是一种分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白，包括19种高度保守的蛋白。Wnt蛋白在细胞发育以及调控细胞生理功能，如细胞增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和极性等方面发挥着关键作用。Wnt蛋白的调节异常可导致发育、增殖和血管发生的异常，最终可引起肿瘤的发生。近年的研究证实，Wnt信号通路在肿瘤的生长、侵袭中发挥着重要作用。大量证据表明miRNA表达的改变通过影响其介导的包括Wnt/β-catenin经典信号通路在内的多条与肿瘤发生、发展相关的信号通路。但对于miRNA是否能调控Wnt信号通路对肿瘤干细胞增殖的影响尚不清楚。因此，本研究旨在探讨调控肺癌干细胞的候选m

6、iRNA，并验证其通过干扰Wnt信号通路对肺癌干细胞的增殖产生影响，以期为肺癌干细胞的靶向治疗提供理论基础。研究目的1.研究Wnt蛋白对富含CD133+CD44+的A549细胞球增殖的调控作用；2.筛选肿瘤组织与癌旁组织中差异表达的miRNA；II3.探讨miRNA介导的Wnt信号通路对A549细胞球增殖的调控作用。材料和方法实验材料：肺腺癌组织以及癌旁组织由南昌大学第二附属医院心胸外科提供，腺癌A549细胞株由南昌大学第二附属医院呼吸科提供。实验方法：1.普通A549细胞、293T细胞和A549细胞球的培养；2.质粒的扩增和提取；3.病毒的包装、纯化与浓缩；4.Wnt5aRNAi、Wnt2R

7、NAi以及miR-4686和miR-21抑制物的转染；5.流式细胞技术检测细胞CD133、CD44的表达；6.MTT法检测细胞增殖抑制率；7.Westernblot检测Wnt5a、Wnt2、DKK2和β-catenin蛋白的表达；8.微列阵芯片检测肺癌组织的miRNA异常表达谱；9.RT-PCR检测miRNA-4686、miR-21、Wnt5a、Wnt2和β-catenin基因的表达。结果1.Wn