鸭新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及应用

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1、山东农业大学硕士学位论文鸭新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及应用姓名：程彦丽申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刁有祥20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要鸭新城疫是由新城疫病毒附ewcastleDiseaseVims，NDV)引起鸭的一种急性、高度接触性、败血性传染病，可造成鸭的大量死亡，使养鸭业损失严重。加强该病的诊断方法的研究对预防和控制鸭新城疫的发生，保护和促进养鸭业的健康发展具有重要意义。核衣壳蛋白(NP蛋白)是鸭新城疫病毒结构蛋白中含量最多、保守性高且具有免疫原性的一种蛋白。为此本研究构建了NP蛋白的原核表

2、达载体并进行了诱导表达，对重组蛋白进行了免疫原性的鉴定，并以NP蛋白为免疫原，制备了NP蛋白的单克隆抗体，建立了以NP蛋白为包被抗原的间接ELISA方法，和检测抗鸭NDV的双抗体夹心ELISA方法。本研究根据GellBank发表的鸭NDVSDWF02株NP基因序列，设计并合成一对特异性引物，扩增出鸭新城疫病毒的NP基因，与原核表达载体pET．28a构建了重组质粒pET28a—NP。将测序正确的重组质粒转化至Rosetta感受态菌种，IPTG诱导后，SDS—PAGE分析表明，54KD的融合蛋白得以表达，主要以包含体形式存在。westemblo

3、t显示，该蛋白能与鸭新城疫的阳性血清发生特异性的反应，表明具有良好的免疫原性。用纯化后的重组蛋白为包被抗原，建立检测鸭新城疫抗体的问接ELISA方法，方阵滴定试验确定最佳包被液为pH9．6的碳酸盐缓冲液，最佳包被浓度为10ng／well，血清最佳稀释度为1：1000。经应用试验表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性，为临床检测鸭新城疫抗体水平提供了一种简单、准确、快速的诊断方法。用纯化的鸭NDVNP蛋白作为免疫原，免疫6．8周龄的BALB／c小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术，经以重组NP蛋白为包被抗原的间接ELISA方法筛选，获得了2株能

4、稳定分泌抗鸭NDVNP蛋白单抗的杂交瘤细胞株Al、B2。经ELISA检测A1、B2细胞上清效价均为为2眩，诱生的腹水的效价分别为107，106。Westemblot和IFA显示，只有A1株能与病毒发生特异性反应。抗鸭NDVNP蛋白单克隆抗体的成功研制，为鸭NDv的免疫学诊断及致病机理的研究奠定基础。用纯化后的腹水Al为捕获抗体，抗鸭NDV多克隆抗体为第二抗体，建立了检测鸭NDV抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定试验确定，单抗和多抗的最佳工作浓度分别为1：1600、1：1600，最佳包被液为CB。应用试验表明该方法具有良好的特异性和重复

5、性，为建立准确、灵敏、易丁普及的鸭NDV诊断试剂盒提供了理论基础。关键词：鸭新城疫病毒；核衣壳蛋白；原核表达；单克隆抗体；ELIsAfPreparationandApplicationofMonoclonalAntibodiestoNucleocapsidProteinofDuck—originNewcastleDiseaseVirusAbstractDuck·originNe、Vcastlediseaseisanacutesepticinfectiousdiseasethatcausedbvduck。01．iginNewcastledis

6、easeVirus．Ithashighmorbidityandmortalityandhasseriousharmtotheduckindustry．Theef’fectiVelydiagosticmethodisoneofthee日bctivemeasurestopreVentandcontr01thedisease．TheNucleocapsidprotein(i．e．NPprotein)，thehighestcontentofstl．uctralprotein，hashighconserVationandimmunogenicity．

7、Therefore，prokaryoticexpressionVectorofNPproteinwasconstructedandexpressed．Then，themonoclonalantibodywaspreparatedaRerNPproteinimmunizingBALB／cmice．Finally，thosewereestablishedthattheindirectELISAfordetectinga11tibodyandthesandwichELISAfordetectionofNDV．Accordingtonucleoti

8、desequenceofNDVSDWF02strain，apairofprimerswasdesignedandsynthesized．ThecompleteNPgeneofad