牛种布鲁氏菌表面蛋白sp41的克隆、原核表达及抗血清的制备

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1、山东农业大学硕士学位论文牛种布鲁氏菌表面蛋白SP41的克隆、原核表达及抗血清的制备姓名：谢冰申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：马卫明20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要本研究的目的是克隆牛种布鲁氏菌SP41基因并构建其原核表达载体，使其在大肠杆菌中高效表达，用表达的融合蛋白为抗原作为抗原制备抗血清，为进一步制备布鲁氏菌病ELISA检测试剂盒打基础。以布鲁氏茵A19疫苗株基因组DNA为模板，利用设计的一对特异性引物对牛种布鲁氏菌SP41基因进行PCR扩增，得到了一条完整的基因，大小为1302bp，然后通过T-A克隆将其连接至pEASY-T3载体上，经PCR

2、和酶切鉴定表明克隆载体构建成功。将构建好的克隆载体进行测序，测序结果证明克隆的基因片段全长1302个核苷酸，编码433个氨基酸的成熟多肽，与已报道的与布鲁氏菌2308、A．13334、S19、9-941序列的核苷酸同源性为100％，与ATCC、CCM4915、M28、M5．90、NI同源性均为99．8％，且其与9-941编码氨基酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pET-32a中，经酶切、PCR鉴定和测序分析，表明重组表达载体pET-32a(+)．SP41构建成功，将此重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导，进行SDS．PAGE分析，结果表明，该

3、基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达产物为分子量约66kDa的融合蛋白，与预期大小符合。通过对诱导条件的摸索发现，IPTG浓度对蛋白表达的影响不大，而37"C，诱导6h，表达效果最好。Western．blotting结果显示，所得重组蛋白具有良好的免疫源性。利用Ni-NTA柱进行纯化，得到了纯化目的蛋白。将纯化的目的蛋白免疫健康雄性家兔，经过4轮免疫过程，用间接ELISA方法测的抗血清抗体效价达到1：51200。以布鲁氏菌SP41重组蛋白为抗原，用临床布鲁氏菌病阳性牛血清为一抗，山羊抗牛IgG为二抗，．进行ELISA检测，探索了SP41蛋白作为诊断蛋白的可行性。关键词：牛种布鲁

4、氏菌、$P41、原核表达、抗血清牛种布鲁氏菌表面蛋白SP41的克隆、原核表达及抗血清的制各AbstractThisresearchistoclonetheSP41geneofBrucellaabortus．ConstructprokaryoticexpressionvectorofpET032a(+)一SP41geneandprepareantiserumusingthefusionproteinasantigenfortheELISAdetectionofBrucellosis．OnepairofspecificprimerstoSP41genewasdesignedand

5、synthesizedbasedonthepublishedsequenceinGenBank．SP41genewasclonedfromgenomicDNAofBrucellaA19vaccinebyPCR．PCRproductWasrecoveredandclonedintopEASY-T3vector．PCRamplificationandendonucleasedigestionresultsconfirmedthattheSP41genehadbeeninsertedintothecloningvectorpEASY-T3．DNASequencinganalysis

6、showedthattheamplifiedfragmentwascomposedof1302nucleotidesandencodes433aminoacids．Compared、析ththereportedSP41genefromwholegenomeDNAsequenceof2308，A一13334，S19，9-941，theaminoacididentityWaS100％，andtheaminoacididentityWas99．8％comparingwithATCC，CCM4915，M28，M5—90，NI．Thegenewasclonedintotheprokar

7、yoticexpressionvectorpET-32a(+)．AfterrestrictionendonucleaseanalysisandsequencingfollowingPCR,itwasconfirmedthattheexpressionvectorpET-32a-SP41wasconstructedsuccessfully．ThepET-32a(+)-SP41WastransformedintoEscherichiacoliBL21cells(processedbyDE3)．Discove