草鱼呼肠孤病毒gcrv-gd108株vp5蛋白的功能及免疫原性分析

《草鱼呼肠孤病毒gcrv-gd108株vp5蛋白的功能及免疫原性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码：10264研究生学号：M090101055上海海洋大学硕士学位论文草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5题目：蛋白的功能及免疫原性分析AnalysisofFunctionandImmunogenicity英文题目：ofGCRV-GD108VP5专业：水产养殖研究方向：水产动物遗传育种姓名：王杭军指导教师：叶星研究员二O一二年五月十九日上海海洋大学硕士学位论文中国水产科学研究院珠江水产研究所草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析王杭军指导教师：叶星研究员申请学位：硕士研究方向：水产动物遗传育种论文递交日期：2

2、012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位和日期：上海海洋大学2012年6月论文评阅人：答辩委员会主席：答辩委员会委员：2012年5月19日ShanghaiOceanUniversityMasterDissertationPearlRiverFisheriesResearchInstituteAnalysisofFunctionandImmunogenicityofGCRV-GD108VP5WangHangjunAdvisor：Prof.YeXingMainfield：FisheryHeredityBreeding2012.05.19上海

3、海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论

4、文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析摘要草鱼（Ctenopharyngodonidellus）是我国淡水主要养殖品种，是“四大家鱼”之一。其饲养成本低，养殖范围广，但养殖过程病害较多，其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡，草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90%，给养殖生产带来了巨大的损失。引起草鱼

5、病毒性出血病的病毒为草鱼呼肠孤病毒（grasscarpreovirus，GCRV），隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus，AQRV）。根据本实验室已获得的草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108株全序列，本研究对其编码VP5蛋白的M5基因序列进行了分析，同时构建其原核表达载体，制备重组VP5蛋白，检测了其NTPase(核苷三磷酸酶，nucleosidetriphosphatases)活性，并对其免疫原性进行了初步研究。1.草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株M5基因序列分析GCRV-GD108的M5

6、基因全长2230bp，含一个开放阅读框(ORF)2178bp。Blast结果显示M5基因编码分子量大小约80ku的蛋白。氨基酸序列分析表明，该蛋白与水生呼肠孤病毒属中多个病毒株的核衣壳蛋白VP5的氨基酸同源性为24%-25%；与哺乳动物正呼肠孤病毒（Mammalianreovirus，MRV）的μ2及禽呼肠孤病毒（Avianreovirus，ARV）的MμA也有较高的同源性（20%）。且该蛋白包含一段μ2样NTP结合保守区域，因此可确定GCRV-GD108株M5基因编码的蛋白为VP5，与MRV的μ2和ARV的μA蛋白同源。2.GCRV-GD108株

7、M5基因原核表达载体的构建及表达以根据已获得的M5基因cDNA序列，分别设计合成带特定酶切位点的特异引物，进行PCR扩增；通过酶切与连接，构建了两种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5，分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达；对培养基、诱导时间、诱I上海海洋大学硕士学位论文导剂浓度和温度等条件进行优化，确定最适表达体系。SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果显示所构建的两种VP5蛋白原核表达载体，均在大肠杆菌中成功地表达了分子量大小与预期相符（约为80ku）的重组蛋白，且表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体

8、经离心、洗涤与超声破碎，离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性，获得纯化的重组蛋白，其中pET30c-M5/BL21(