tgf-β1诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化及其相关分子机制的研究

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1、河北医科大学硕士学位论文TGF--β1诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化及其相关分子机制的研究姓名：张娜申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：徐春琳201203中文摘要TGF-B1诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化及其相关分子机制的研究摘要‘目的：卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，早期缺乏特异性症状，当患者就诊时多数已是临床晚期，化疗耐药和术后易复发的存在使其5年生存率仍然徘徊在30％，严重威胁妇女健康。卵巢癌的浸润和转移是影响患者生存率的主要因素，卵巢癌发生侵袭转移是一个多因素参与的极其复

2、杂的过程，目前尚不了解其确切的分子机制。约90％的卵巢肿瘤起源于卵巢表面上皮(ovariansurfaceepithelium，OSE)，因此研究上皮性卵巢癌(ovarianepitheliumcancer,OEC)的侵袭转移机制对于卵巢癌的早期诊断、提高生存率及改善预后具有重要意义，目前对肿瘤侵袭转移机制的研究是肿瘤研究的热点之一。越来越多的形态学和分子学证据表明，上皮一间质转化(Epithelial．mesenchymaltransition，EMT)对上皮源性的肿瘤细胞的侵袭转移有重要影响，

3、最新研究表明，经过EMT转变的癌细胞能够获得干细胞特性。EMT是指在一定条件下有极性的上皮细胞在形态上转变成类似间质细胞，失去极性呈分散状态，细胞骨架发生改变，同时获得间质细胞的特性能够在细胞基质间移动，同时上皮细胞和间质细胞标志物表达发生改变。EMT最重要的标志性变化是上皮一钙黏蛋白(E—cadherin)的减少或丢失和神经一钙黏蛋白(N．cadhefin)的增加。EMT是基本的生理病理现象，参与胚胎发育、器官形成和肿瘤转移，越来越多的研究显示其在肿瘤的侵袭转移中起着重要作用，因而已成为肿瘤研究

4、中的热点。但对其调控机制的认识仍然有限，因此探讨恶性肿瘤发生EMT的诱因，探寻信号转导通路和转录因子对EMT过程的调控机制，对于寻找新的干预靶点为癌的治疗提供新的线索具有重要意义。研究证实肿瘤微环境中多种生长因子可以诱导肿瘤细胞发生EMT，其中TGF．131是目前备受关注诱导EMT的关键因素。本研究通过体外培养上皮性卵巢癌细胞株，观察转化生长因子-131(TransformingGrowthFactor-131，TGF．131)对上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化及侵袭转移的影响；同时通过研究磷酸肌

5、醇3一激酶／丝氨酸一苏中文摘要氨酸激酶(phosphoinosit01．3-kinase／sefine．threonineproteinl(inaseB．P13K／Akt)信号传导途径及其下游分子蛋白水平表达变化，旨在从分子水平上探讨TGF．B1诱导上皮性卵巢癌细胞发生EMT及侵袭转移的信号转导机制，对深入认识卵巢癌细胞的恶性生物学行为具有重要意义，可能为预防和治疗卵巢癌的侵袭转移提供一种新的思路和实验依据。方法：将人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV-3、人卵巢粘液性囊腺癌细胞株3AO置于37℃，饱

6、和湿度5％C02，含lO％胎牛血清RPMI．1640培养基中常规培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。1．光镜观察：将不同浓度的TGF．pl作用于SKOV-3和3AO细胞株，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的形态变化。2．MTT法：调整细胞浓度为3×104／ml，以每孔100ul培养于96孔培养板中，进入对数生长期后用不同浓度TGF．p1(0、1、2、5、10ng／m1)作用不同时间(24h、48h)，以0ng／mlTGF．p1为对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TGF—Bl对细胞增殖的影响

7、。3．应用24孔Transwell侵袭小室进行SKOV-3和3AO细胞的侵袭试验，各实验组连续培养48小时后取出Transwell小室，擦去Transwell小室上面的细胞，用甲醛固定，结晶紫染色，镜下计数穿膜细胞数，与对照组相比较，检测细胞侵袭能力的改变。实验分组如下：@Control组：加入等量PBS作为趋化剂作用于癌细胞@TGF．D1组：(1、2、5、10ng／m1)的TGF一131作用于癌细胞@LY294002组：10岬ol／mlLY294002作用于癌细胞@TGF．131+LY29400

8、2(10ng／m1)组：P13K抑制剂LY294002作用30min后加入(1Ong／m1)的TGF．Dl。4．Westernblot检测各组SKOV-3和3AO细胞中p-Akt(Thr308)蛋白、Twist蛋白、E．cadherin蛋白、N．cadherin蛋白的表达情况。各组蛋白均为药物作用48h后提取。实验分组如下：@Control组：用含10％胎牛血清的RPMI．1640细胞培养基培养癌细胞@TGF．p1组：10ng／ml的TGF．131作用于癌细胞@LY294002组：