taco特异性sirna靶向载体系统的构建及鉴定

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1、摘要TACO特异性SiRNA靶向载体系统的构建及鉴定1摘要抑制巨噬细胞(M①)的吞噬体与溶酶体融合是结核分枝杆菌(Mtb)逃避免疫系统杀伤和在机体内长期潜伏的主要机制。近年的研究发现，Mtb感染后可诱导MO内的一种富含色氨酸天冬氨酸膜蛋白(Tryptophan．aspartatecontainingcoatprotein，TACO)迅速分布并局限于含活Mtb的吞噬体的膜上，阻断Mtb吞噬体与溶酶体的融合。进一步的研究发现，TACO是被吞噬的Mtb在M①内生存必不可少的条件，阻断TACO的表达可有效

2、促进MQ吞噬体与溶酶体的融合，从而提高巨噬细胞杀伤和清除Mtb的能力。因此，通过某种有效而特异的手段抑制M①内TACO的表达可能是一种清除体内Mtb最为直接和有效的办法。本研究构建了M①TACO基因特异性小干扰RNA(siRNA)的真核表达质粒，通过特异性RNAi(RNAinterference，RNAi)抑制MO内TACO的表达，并且利用经过基因改造的耻垢分枝杆菌Msl．2c作为载体，使其在M①内定位表达TACOmRNA特异性的siRNA，通过RNA干扰技术高效特异地抑制TACO表达，从而清除体

3、内的Mtb，为进一步利用siRNA研究基因的功能及治疗结核病奠定了基础。第一部分TACO特异性siRNA真核表达质粒的构建目的：构建针对TACO基因的特异性siRNA的真核表达质粒，为后续的研究奠定基础。方法：参照invitrogen公司在线设计siRNA软件设计三对互补的单链DNA，包括siRNA的正义链和反义链，并且设计了一组对照序列。在互补单链中间连有loop环，loop环两侧为21bp的以正反向组合的干扰序列，两端为BamHI和BbsI酶切位点的粘性末端。针对这些筛选的siRNA序列，合成

4、该序列的OligoDNA，经退火形成双链DNA，与经BamHI和BbsI双酶切后的pGPU6／GFP／Neo载体连接，构建pGPU6／GFP／Neo．taco(简称pST)干扰质粒。转化大1本课题受江西省自然科学皋金课题(2007GQYl460)资助。II摘要肠杆菌后，挑取重组阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序结果证实，siRNA核苷酸序列正确插入到表达载体pGPU6／GFP／Neo中，成功构建了TACO基因特异性的siRNA表达质粒pSTl、pST2、pST3及

5、对照siRNA表达质粒pST4。结论：成功构建了针对TACO基因干扰序列的表达载体pST。第二部分siRNA真核表达质粒在细胞内的表达及其抑制TACO表达效果的检测目的：将干扰质粒pSTl、pST2、pST3和对照质粒pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7和293T细胞，在细胞水平检测TACO的表达变化。方法：采用RT-PCR方法自小鼠巨噬细胞系RAW264．7中扩增获取taco基因片段，并将之克隆入真核表达质粒pQE30中，构建重组质粒pQE30．taco。以pQE30．taco作为标准物建

6、立荧光定量PCR法检测taco基因水平的标准曲线。在此基础上，本部分研究采用了三种不同的方法对taco特异性siRNA表达质粒对巨噬细胞TACO表达的影响进行了研究：(1)采用pSTl、pST2、pST3、pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7，分别采用荧光定量RT-PCR和免疫印迹法在mRNA和蛋白水平检测巨噬细胞的TACO表达变化。但由于RAW264．7细胞转染效率低下，pSTl、pST2、pST3、pST4转染后荧光定量RT-PCR和免疫印迹法均未检测到TACO的表达有明显的改变。(2)

7、采用pSTI、pST2、pST3、pST4转染小鼠巨噬细胞系RAW264．7，然后以TACO特异性抗体为一抗，红色荧光蛋白标记的二抗对细胞进行免疫荧光染色，在单细胞水平比较获pST质粒转染(表达绿色荧光蛋白)和未获转染的细胞的红色荧光的荧光强度，评价siRNA表达质粒对TACO表达的影响。(3)利用293T细胞转染效率高，本身不表达TACO的特点，构建TACO与红色荧光蛋白(PEP)表达基因的融合基因表达质粒：pCDNA3．1．Red．taco(简称p3．1．RT)，用p3．1。RT和TACO特异

8、性siRNA表达质粒共转染293T细胞，再采用免疫印迹方法检测TACO的表达改变。结果：转染RAW264．7细胞后荧光定量PCR和westernblot图片表明没有明显的差异。在pST干扰质粒转染RAW264．7细胞后用TACO蛋白做细胞免疫荧光表明细胞内TACO表达明显的降低。在293T细胞中，在蛋白质水平检测到了TAC0的变化。111摘要IrlllllllllllIUlIrllIII＼1958088结论：pST干扰质粒可使tacomRNA及蛋白水平表达下降。第三部分重组耻垢分枝