mir9在胶质瘤恶性行为中的作用其机制的研究

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1、第四军医大学硕士学位论文siRNASmallinterferenceRNA小干扰RNAUTRUntranslatedregion非编码区-3-第四军医大学硕士学位论文MiR-9在胶质瘤恶性行为中的作用及其机制的研究硕士研究生：杨帆导师：张剑宁教授辅导教师：王涛副教授第四军医大学附属西京医院神经外科，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金（项目编号：81172289）中文摘要【背景】胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。根据胶质瘤组织病理学特点和临床标准，世界卫生组织（WHO）将其分为I-IV级。I级胶质瘤在儿童多发，且一般认为I级胶质瘤为良性肿瘤，可通过手术切除治

2、愈，很少发生恶性进展；相比之下II、III级胶质瘤具有一定侵袭性且恶性程度更高，预后较差；恶性程度最高且预后最差的是IV级胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM)，根据其是否由低级别胶质瘤进展而来，可将其分为原发性胶质母细胞瘤和继发性胶质母细胞瘤。MicroRNAs(miRNA)为普遍存在于动植物体内的内源性小片段非编码RNA分子，可通过与多个靶基因信使RNA(mRNA)结合从而调控基因的表达。miRNAs在进化中高度保守性，提示其可能在生命功能的诸多方面发挥重要作用。与肿瘤相关的miRNAs可根据其对肿瘤发生发展的调节作用，分为促癌miRNAs

3、和抑癌miRNAs。目前的研究主要集中于挖掘与正常组织或细胞系相比，肿瘤中miRNAs的差异表达，进而研究其功能及寻找下游调控靶基因。已有大量研究表明miRNAs在包括胶质瘤在内的肿瘤中发生差异表达，这些miRNAs在肿瘤的发生和进展中发挥重要作用。-4-第四军医大学硕士学位论文MiR-9在动植物中高度保守，且已被证实在多种肿瘤的发生与发展中发挥了重要作用。然而，其在胶质瘤中的功能却不明确。MiR-9在胶质瘤中的表达有何特点？其异常表达对肿瘤的发生发展有何影响？MiR-9又是通过调节哪些重要靶基因来影响胶质瘤的进展过程？在胶质瘤中miR-9异常表达的机制是什么？上述问题的研

4、究将有助于探索胶质瘤的恶性行为机制，探究将miR-9作为治疗靶点的可行性，为胶质瘤的临床治疗提供了新策略。【目的】探究胶质瘤临床样本及其胶质瘤细胞系中miR-9的表达情况；研究miR-9在胶质瘤恶性进展中的生物学作用；寻找及鉴定miR-9调节的功能相关靶基因；寻找调控miR-9的转录因子和表观遗传学调节因素，为胶质瘤的预防、早期诊断以及治疗靶点选择提供新的理论依据。【方法】1.通过qRT-PCR检测临床组织样本和胶质瘤细胞系中miR-9的表达水平；2.体外A172细胞转染miR-9mimic和U251细胞转染miR-9inhibitor分别上调和下调miR-9的表达，通过M

5、TT实验、流式细胞术、划痕实验、Transwell实验、血管生成实验和粘附实验分析miR-9对胶质瘤细胞多种生物学行为的影响；3、运用生物信息学分析软件预测miR-9潜在的功能靶基因，分子克隆技术将预测靶基因3’UTR结合区域连接至PGL3报告基因质粒；4、利用荧光素酶报告基因实验鉴定miR-9直接调控靶基因，并用qRT-PCR、Westernblot和ELISA实验在mRNA和蛋白水平上进行验证；5、利用生物信息学网站预测对miR-9调节的转录因子及H3K27组蛋白甲基化，qRT-PCR检测转录因子与H3K27组蛋白甲基化状态；6.采用siRNA干扰技术和瞬时转染过表达质

6、粒下调/上调转录因子和组蛋白去甲基化酶，分析miR-9的表达情况。【结果】1.qRT-PCR分析结果显示，与正常脑组织相比，在胶质瘤组织样本中miR-9的表达水平增高；与正常胶质细胞HEB相比，miR-9在胶质瘤细胞系中均高表达，其中在胶质瘤细胞A172中相对表达较低，在U251细胞系中表达较高；与正常肠上皮细胞相比，miR-9在结直肠癌中表达较高；而与正常肾上皮细胞相比，在肾癌中miR-9-5-第四军医大学硕士学位论文呈现低表达，表明miR-9的表达具有组织特异性；2.A172细胞转染mimic后可有效上调miR-9的表达水平，MTT结果显示miR-9促进胶质瘤细胞增殖能

7、力，细胞周期分析过表达miR-9组细胞进入S期细胞增多，G1期细胞数减少；上调miR-9表达后，A172胶质瘤细胞迁移和侵袭细胞数明显增高，过表达miR-9组条件培养基培养内皮细胞HUVEC，增强了HUVEC细胞体外成管能力；而同时对U251细胞系转染inhibitor后，细胞增殖能力下降、细胞周期S期细胞数量显著减少，G1期细胞增多，Transwell结果可见下调miR-9组穿过小室细胞数量明显减少，条件培养液培养HUVEC细胞，成管能力显著减弱；3.外源转染miR-9mimic可显著提高HUVEC细胞miR-9