hsa-microrna-218与颗粒溶素表达关系的探讨

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文MHCMajorhistocompatibilitycomplex主要组织相容性复合体miRNAMicro-ribonucleicacid微小核糖核酸mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸minminute分钟mlmilliliter毫升NKNaturalkillercell自然杀伤细胞PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PBSTPhosphatebufferedsolutiontween磷酸盐吐温缓冲液PMAPhorbol12

2、-myristate13-acetatefor佛波酯PVDFPolyvinylidenedifluoride聚偏二氟乙烯PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰氨凝胶电泳PEP-phycoerythrin藻红蛋白pHPotentialofhydrogen酸碱度Quantitativerealtimepolymerasechain实时荧光定量聚合酶联反qRT-PCRreaction应RTReversetranscription逆转录RNaseRibonuclease核糖核酸酶RNARibonucleicacid核糖核酸rpmRoundpermi

3、nute转/分SDSSodiumdodecylsufate十二烷基硫酸钠SSCSidescatter侧向角散射snRNASmallnuclearribonucleicacid细胞内有小核核糖核酸TEMEDN,N,N,N,tetramethyl-ethylenediamineN,N,N,N,四甲基乙二胺TBTuberculosis结核病TrisTrihydroxymethyl-aminomethane三羟甲基甲烷UTRUntranslatedregion非编码区μlmicroliter微升2万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文Hsa-microRNA-218与颗粒溶素表达关系的探讨

4、摘要目的：将颗粒溶素（Granulysin,GLS）表达质粒与microRNA（miRNA）干扰质粒共转染入293T细胞中，在细胞层面上观察hsa-microRNA-218(miR-218)对GLS蛋白表达的干扰效果；应用Taqman探针、qRT-PCR检测miR-218在结核病（Tuberculosis,TB）人血清、血浆中的表达情况，为进一步探讨miR-218作为TB检测生物标志物在诊断结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）感染的应用方面提供方法和实验基础；运用流式细胞术（Flowcytometry，FCM）从++外周血中筛选出CD4T细胞、

5、CD8T细胞，用LV3-miR-218等包装慢病毒感染后，Western-blot探讨miR-218和GLS表达间的关系。方法：1.抽提佛波酯（phorbol12-myristate13-acetatefor,PMA）激活的THP-1细胞的总RNA，逆转录后PCR扩增GLS基因，将其克隆至pDsRed-Express-C1，构建GLS表达质粒pDsRed-GLS。将pDsRed-GLS与pGenesil-miR-218（pGenesil-miR-control）共转染293T细胞，36h后激光共聚焦显微镜观察两种质粒在细胞中的表达情况，48h后提取细胞总RNA和蛋白，RT-PCR和

6、WesternBlot检测miR-218对GLS表达的影响。3万方数据重庆医科大学硕士研究生学位论文2.设计miR-218及内参U6snRNA特异性逆转录引物及Taqman探针，抽提TB患者和健康人群对照组血清、血浆标本中的总RNA，逆转录反应后，运用qRT-PCR检测miR-218的表达情况。同时比较miRNA专用提取试剂盒和TRIzol试剂在TB血清、血浆中抽提miR-218的效率；miR-218在TB血清和血浆中的含量；血清标本经预热处理和10%SDS溶液预处理对抽提miR-218的影响。+3.运用FCM从TB患者和健康人群的外周血中分选出CD4T细+胞、CD8T细胞，比较两

7、种细胞的比例和比值变化；qRT-PCR检测++miR-218在外周血CD4T细胞、CD8T细胞中的表达情况；慢病毒LV3-miR-218/LV3-miR-control、LV10-miR-218inhibitor/++LV10-miR-controlinhibitor感染CD4T细胞、CD8T细胞后，Western-blot探讨miR-218和GLS表达间的关系。结果：1.酶切和测序结果证实重组质粒pDsRed-GLS构建成功，且能与miRNA干扰质粒在293T细胞中