原发性胆汁性肝硬化外周血中颗粒溶素的基因表达水平的检测论文

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1、原发性胆汁性肝硬化外周血中颗粒溶素的基因表达水平的检测论文作者:钱琤,陈波,周晔,谷明莉,吴传勇,.freelan探针技术，以18sRNA为内对照，测定了60例PBC性心脏病患者外周血中GNLYmRNA的含量，以健康对照组为对照。结果GNLYmRNA在60例PBC患者的表达范围为5.35×107～4.61×109拷贝/μgRNA，均值为（2.7±2.5）×108拷贝/μgRNA；100例健康对照者均值为（3.0±1.9）×107拷贝/μgRNA。PBC组GNLYmRNA的含量显著高于疾病对照乙型肝炎肝硬化组和健康对照组（P0.01）。结论通过FQ-PCR

2、方法检测出PBC患者GNLYmRNA的含量显著高于健康对照组，GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。【关键词】PBC；GNLY；逆转录-聚合酶链反应原发性胆汁性肝硬化（primarybiliarycirrhosis，PBC）是一种原因不明的自身免疫性肝病.freelRNA在PBC患者外周血中的表达及临床意义。1材料与方法1.1材料1.1.1研究对象60例经临床确诊的PBC患者均为长征医院住院病人，其诊断均符合美国肝病学会（AASLD）2000年推荐的PBC诊断标准［4］，其中男5例，女55例，男女比例为1：11，发病年龄(45.6±10.2)岁

3、。正常对照组为100例健康体检者。1.1.2主要仪器和试剂RNeasyMiniKit(QIAGEN)，TaqmanReverseTranscriptionRegents(AppliedBiosystem)，淋巴细胞分离液（上海生化试剂公司），TaqMan2×PCRMasterMix，TaqmanReverseTranscriptionRegents(AppliedBiosystem)，引物及TaqMan水解探针的合成(上海生工)、DNA测序分析(上海联合基因生物技术公司)。GeneAmp7900SequenceDetectionSystems（美国PEB

4、iosystems公司）。1.1.3引物、探针的设计与合成用BeaconDesigner2.1软件设计GNLY和18srRNA的基因专一性的引物和探针，GNLY上游引物：5’ACTGAAGAAGATGGTGGATAAGCC3’；下游引物：5’GCCCTGGGTAACTCTAGACTGA3’；探针：FAMCGGAACCTCCAGTCAGAAGACCAGATAMRA。内参18srRNA上游引物：5’ACATCCAAGGAAGGCAGCAG3’；下游引物：5’TTCGTCACTACCTCCCCGG3’；探针：FAMCGCGCAAATTACCCACTCCCGAT

5、AMRA。正反向引物、Taqman探针（FAMTAMRA标记）均由上海生工生物技术公司合成。1.2实验方法1.2.1抽提外周血单个核细胞和总RNA取枸橼酸钠抗凝静脉血5ml，用淋巴细胞分离液得到PBMC，QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测所提取的总RNA的质量和浓度，并计算RNA的含量。1.2.2cDNA的合成反转录按试剂说明书操作，反转录体系如下：RNA2.85μl，10×TaqmanRTBuffer1.0μl，40mMMagnesiumChloride2.2μl，deoxyNTPSMixture2.0μl，

6、RandomHexamers0.5μl，RNAaseInhibitor0.2μl，MultiScribeReverse0.25μl，TranscriptaseRNase-freein→94℃3min终止反应。cDNA保存于-20℃备用。1.2.3定量阳性模板和内参照模板的制备PCR反应体系如下：蒸馏水34.7μl，10×Exbuffer5μl，ExTaq酶0.3μl，dNTP4μl，上下游引物各2μl，cDNA2μl，GNLY和18srRNA的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化，将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行连接构建重组质粒p

7、MD18-T-GNLY和pMD18-T18srRNA进行酶切及测序鉴定。1.2.4绘制标准曲线将质粒pMD18-T-GNLY和pMD18-T-18srRNA经紫外分光光度仪测定浓度换算出拷贝数，用TE缓冲液以1：10比例稀释成各种不同拷贝数浓度。上述不同稀释度的两种标准模板1μl，2×buffer5μl，GNLY或18srRNA上、下游引物各0.2μl，Taqman探针0.2μl，无RNA酶水3.4μl，共10μl反应体系。扩增条件均为50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min40个循环。反应结束后计算机自动绘制出GNLY和内参18s

8、rRNA的标准曲线。1.2.5定量PCR检测GNLY的表达将阳性模板、患者和对照