靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链il论文

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1、靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL论文伊正君，朱道银，杨春，李俊明，何永林，陈全【关键词】靶向ConstructionandidentificationofaMycobacteriumsmegmatisstraintotargetedlydelivereukaryoticcoexpressionplasmidencodinghumangranulysinandmurinesinglechainIL12【Abstract】AIM:ToconstructarebinantMycobacteriumsmegmatisstrainthatcantargetedlydelivertheeu

2、karyoticcoexpressionplasmidpZM03encodinghumangranulysin(GLS)andmurinesinglechainIL12intomacrophages.METHODS:Codingsequencesofhumangranulysin,murinesinglechainIL12andOriMultaneouslyclonedintopBudCE4.1,ultiplepromoterstoformtheshuttleplasmidpBudCE4.1/GLS/IL12/OriM(simplynamedpZM03).Theshuttlep

3、lasmidedintomc2155andidentifiedfromtherebinantsbyPCR.ThetargetingpropertyoftherebinanturinemacrophageRAycobacteriumsmegmatisasanattenuatedbiologicalvector.【Keysmegmatis;shuttleplasmid;macrophage【摘要】目的:构建携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠单链IL12基因的真核共表达载体pZM03，并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS，小鼠单链IL1

4、2基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中.freelc2155，通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒；通过与小鼠巨噬细胞株RA03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.【关键词】颗粒溶素；白细胞介素12；耻垢分枝杆菌；穿梭质粒；巨噬细胞0引言结核病位居单一病原引起死亡的严重传染病之首［1］.在结核病的感染、发病与治疗过程中，宿主本身的免疫素质和免疫状态是决定预后转归的重要因素［2］.其中巨噬细胞既是重要的抗原呈递细胞，也是参与形成潜伏感染的关键环节.本研究目

5、的旨在构建一种携带人天然颗粒溶素（granulysin，GLS）和小鼠单链IL12基因的真核共表达载体pZM03、并可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗.为明确该重组疫苗的靶向递送和目标基因在巨噬细胞内的转录和表达效果，我们首先在细胞水平上进行了初步探索.1材料和方法1.1材料携带人GLS基因的质粒pGLS738由本实验室构建；携带小鼠单链IL12基因的质粒pSFGmIL12由GrahamJ.Liechke博士惠赠，其中p40，p35两亚单位基因由一45bp的Linker连接，其编码产物的生物学活性已在活体内证明；含有分枝杆菌复制子OriM的质粒pM

6、V261及耻垢分枝杆菌mc2155由Torin博士［3］惠赠；多启动子真核共表达载体pBudCE4.1购自Invitrogen公司；质粒pUC118购自大连宝生物公司；质粒pEGFPC1，E.coliTop10为本室保存；小鼠巨噬细胞株RAA）、限制性核酸内切酶、高保真ProbestTaq酶、T4DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarkerDL2000等均购自大连宝生物公司；Lipofectamin2000购自Invitrogen公司；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德公司；RPMI1640培养液购自Gibco公司；小牛血

7、清为杭州四季青公司产品.1.2方法1.2.1pZM03质粒的构建根据GenBank（登录号：NM_006433）中人GLS的cDNA序列，设计引物P1，P2，分别含有BspEI，HindIII和BamHI酶切位点.P1的序列为5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGGGCCGTGACTACAGGACCT3′;P2的序列为5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCACCTGAGGTCCTCACAGAT3′，引物由大连宝生物公司合成.由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在引物设计