磁标记羊膜间充质干细胞移植对大鼠海马齿状回组织再生的实验的研究

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1、摘要磁标记羊膜间充质干细胞移植对大鼠海马齿状回组织再生的实验研究博士研究生：曾光伟导师：杨波教授郑州大学第一附属医院神经外科河南郑州450052摘要背景和目的脑外伤、脑出血和脑梗塞等脑损伤是人类致残的主要原因，存在抢救存活后预后差，目前无特殊治疗方法。本研究通过三个阶段探讨磁标记羊膜间充质干细胞移植对大鼠海马齿状回组织再生的影响。1、羊膜组织来源的细胞通过细胞形态学观察、流式细胞仪检测、MTT法细胞活性检测和神经元样细胞分化等鉴定为问充质干细胞，为超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagneticironoxidenanoparticles，SPIONs)标记细胞的实验研究提供干细胞来

2、源。2、采用SPIONs单次和多次标记法标记羊膜间充质干细胞，探讨SPIONs标记羊膜间充质干细胞的安全浓度，明确SPIONs安全浓度对羊膜问充质干细胞向神经元样细胞分化的影响；通过磁共振检测SPIONs标记的干细胞在体外和体内的信号存在和改变，为羊膜I、日J充质干细胞移植治疗相关疾病的活体示踪提供实践基础。3、SPIONs标记的羊膜间充质干细胞移植入缺血缺氧性脑损伤侧脑皮质，MRI示踪干细胞移植后在宿主脑内分布和迁移情况，实现活体的无创性和连续性动态监测；通过免疫组织化学染色检测海马齿状回组织的再生，探讨干细胞在组织再生中扮演的角色。摘要材料和方法：1．羊膜间充质干细胞的原代培养和神经元样细

3、胞分化酶消化和贴壁培养法获取羊膜组织中细胞，通过细胞形态学观察、流式细胞仪检测、MTT法细胞活性检测和神经元样细胞诱导分化等鉴定羊膜来源的间充质干细胞。P3代生长状态良好的羊膜间充质干细胞培养于细胞诱导培养基，诱导细胞分三组。在1，2，4和7天分别进行1、MTT法分析细胞诱导培养基的细胞毒性；2、流式细胞仪分析间充质干细胞膜表面特异性分子的改变；3、RT-PCR和免疫细胞化学染色探讨羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的潜能。2．SPIONs标记羊膜间充质干细胞在体内外细胞磁共振成像SPIONs的浓度分别是3．5，7，14，and28l上g／ml的细胞生长培养基(CytokineGrowthMe

4、dium，CGM)或细胞诱导培养基(CIM)应用于本研究。两种SPIONs标记法应用于本研究：1、单次SPIONs标记法：细胞培养首次(Od)更换的培养基含SPIONs，此后ld、2d和4d更换的培养基不含SPIONs；2、多次SPIONs标记法：细胞培养首次(0d)更换的培养基含SPIONs，此后1d、2d和4d更换的培养基含SPIONs。根据和细胞培养基不同和SPIONs的标记方法不同分为六组：l、细胞生长培养基组；2、细胞生长培养基+单次SPIONs标记组；3、细胞生长培养基+多次SPIONs标记组；4、细胞诱导培养基组；5、细胞诱导培养基+单次SPIONs标记组；6、细胞诱导培养基+多

5、次SPIONs标记组。细胞生长培养基(CGM)培养的细胞分别收获于1、2、4和7d，各时间点获得细胞分为三组分别行MTT法、普鲁氏蓝染色和流式细胞仪检测；细胞诱导培养基(CIM)培养的细胞分别收获于l、2、4和7d，各时间点获得细胞分为三组分别行MTT法、普鲁氏蓝染色、免疫细胞化学染色、RT-PCR和流式细胞仪检测；无SPIONs的细胞生长培养基组和细胞诱导培养基组作为对照组。羊膜间充质干细胞培育于SPIONs浓度分别为3．599／m、7gg／ml、14gg／ml和28gg／ml的细胞生长培养基，共同孵育1天后消化、离心，悬于1．5mll％琼脂糖的Ependoff管，冷却固化，SIEMEMS3

6、．0TrioTimI—classMR扫描仪成像磁共振成像，完成SPIONs标记羊膜间充质干细胞体外细胞磁共振成像。Wistar大鼠分组：1、14gg／mlSPIONs标记的羊膜间充质干细胞动物移植组，2、14肛g／mlSPIONs动物移植组。移植细胞制备：14Irtg／mlSPIONs标记的羊膜间充质干细胞II摘要(1天)，l×106细胞混悬液51xl作为移植备用。细胞移植方法：健康Wistar大鼠腹腔麻醉，前囟前0．5mm、旁开3．0mm为中心钻孔径约为1illnl的孔，缓慢注射至左侧脑皮层(距离硬脑膜表面2mm)。对照组使用5rtl14pg／mlSPIONs的PBS液。移植后1天、1、4和

7、7周行MRI检查。14I．tg／mlSPlONs动物移植组方法同细胞移植方法，完成SPIONs标记羊膜问充质干细胞体内细胞磁共振成像。3．羊膜间充质干细胞移植对脑缺血缺氧性大鼠海马组织再生的影响将7日龄新生大鼠共48只，随机分成6组，各组8只：A组(假手术组)：分离不结扎左侧颈总动脉；B组(模型制备组)：制备模型成功，不进行细胞移植；C组(模型制备+损伤侧PBS液移植组)：制备模型成功，移植5pl