杜氏盐藻鞭毛蛋白质组学分析和gapdh基因及其调控区的克隆与功能鉴定

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1、郑州大学2008年博士论文杜氏盐藻鞭毛蛋白质组学分析和GAPDH基因及其调控区的克隆与功能鉴定杜氏幽剿验I毛蛋白质组学分析和GAPDH基因瓦鼠眍的克隆与功能鉴定博士研究生贾岩龙导师薛乐勋研究员郑州大学第一临床学院，郑州450052中文摘要鞭毛／纤毛是细胞表面的特化细胞器，在不同的物种中具有高度保守性。实质上鞭毛和纤毛结构基本相同，因此在真核生物中常互相指代。鞭毛／纤毛不仅存在于单细胞生物，也存在于高等动物细胞中。如，纤毛几乎存在于人类所有细胞，包括胚胎发育过程中的细胞、脑神经元以及肾脏上皮细胞等。除了具有典型的运动功能之外，纤毛／鞭

2、毛在感官和生长发育过程中也发挥至关重要的作用。研究表明，在多种组织细胞中纤毛结构或功能相关基因的缺陷或突变可能导致多种人类疾病的发生。如，多囊肾(Polycystickidneydisease，PgD)和一些生长发育性疾病。最近的一些研究提示纤毛可能在肿瘤发生中起重要作用：在肿瘤发生中起重要作用的信号途径如Hedgehog(Hh)、Smoothened和Wnt似乎都依靠纤毛来传递信息的。迄今为止，对于鞭毛／纤毛的研究主要是在线虫(Caenorhabditiselegans)、果蝇(Drosophila)、四膜虫(Tetrahymen

3、a)、斑马鱼(zebrafish)、小鼠以及单细胞模式生物一衣藻(Chamydomonas)中进行的。因为其鞭毛／纤毛在结构和功能上与人类的纤毛极其相似。因此，这些细胞器郑州大学2008年博士论文杜氏盐藻鞭毛蛋白质组学分析和GAPDH基因及其调控区的克隆与功能鉴定是人类纤毛相关缺陷或突变性疾病十分理想的研究模式。通过对模式生物进行研究不仅可以帮助我们了解鞭毛／纤毛结构功能与人类相关疾病的关系，而且可以阐明许多至关重要的生命过程，包括细胞分裂周期、细胞凋亡和发育及信号转导等。因此，为了解纤毛在发育和生理过程中的作用，很有必要对纤毛装配

4、和功能所必需的基因及其蛋白产物进行研究和鉴定。杜氏盐藻(Dunaliellasalina，Dsalina)是一种比较独特的高度耐盐单细胞真核绿藻：具双鞭毛而能游动，没有细胞壁，含有一个较大的杯状叶绿体能进行光合作用；可在含有0．05M一5MNaCl的环境中生长。极其耐盐的抗逆性能力，简单的细胞结构以及便利的培养条件使杜氏盐藻成为重要模式生物和遗传学研究的良好材料。盐藻细胞可利用其鞭毛进行运动和交配期细胞间的识别。由于盐藻鞭毛位于细胞的表面，所以易于分离并进行生化和遗传分析。所以，以盐藻作为模式生物来研究真核细胞鞭毛的装配和功能有如下

5、独特的优点：(1)其单倍体基因组适于进行表型遗传分析；(2)应用电转法、粒子轰击法(基因枪法)和玻璃珠法等转化方法，其核及叶绿体基因组可进行遗传转化和表达分析；(3)突变体和分子标记可用于相关基因的克隆鉴定。(4)在盐藻中可以大量提取并纯化鞭毛蛋白以进行有效的蛋白水平分析和鉴定。因此，盐藻的eDNA克隆文库、遗传学分析方法的应用以及可进行蛋白提取和纯化等均有利于蛋白质组学技术在盐藻中的应用。除了作为抗逆性和鞭毛研究的模式生物外，杜氏盐藻作为一种新Ⅱ郑州大学2008年博士论文杜氏盐藻鞭毛蛋白质组学分析和GAPDH基因及其调控区的克隆与

6、功能鉴定型生物反应器的研究正越来越受到人们的关注。杜氏盐藻用作生物反应器，具有培养简单、营养成分含量高、表达产物下游纯化过程简单等优越性。作为一种新型生物反应器，较之常规的微生物发酵、转基因动植物物等生产体系，具有成本低、高效低廉等优点。盐藻本身属于真核生物，做为宿主能够产生近天然活性的重组蛋白，弥补了原核表达系统的缺陷。生产一些外源生物活性物质如内源性肿瘤血管生成抑制剂(血管抑素angiostatin，内皮抑素endostatin等)、乙型肝炎病毒的疫苗、禽流感疫苗，特别是口服疫苗等，更具有独特的优越性。因此，通过对杜氏盐藻生物反

7、应器系统的研究可以为生产高效、价廉的药用蛋白，继而为临床药理病理研究及应用提供理论和实践基础。甘油醛3一磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)是糖酵解过程中的关键酶，它催化3一磷酸甘油醛转变成1，3一二磷酸甘油酸。由于参与了细胞的基本代谢过程，被认为是看家基因，可以作为研究基因表达量的内在对照。杜氏盐藻鞭毛蛋白质组学分析结果表明，GAPDH可能是杜氏盐藻鞭毛组分并在鞭毛的组装和运动中起非常重要的作用。而且，GAPDH基因的5’端调控序列可作为高表达的启动子用于表达外源

8、基因。目前，国内外尚未见以盐藻作为模式生物研究鞭毛结构和功能的报道。本研究第一部分以杜氏盐藻的鞭毛为研究对象，分离盐藻鞭毛并提取鞭毛蛋白，采用蛋白质组学的技术和方法包括生物质谱分析和生物信息学等在蛋白质水平进行鞭毛／纤毛结构和功能的初