杜氏盐藻mar序列结合蛋白的原核表达与功能初步分析

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1、郑州人学2007年硕+论文杜氏盐藻MAR序列结合蛋白的原核表达及功能初步分析杜氏盐藻MR序列结合蛋白的原核表达及功能初步分析硕士研究生：冯英才导师：薛乐勋郑州大学细胞生物学研究室郑卅I450052中文摘要核基质附着区(matrixattachmentrcgions，MARs)又被称作核骨架附着区(scaffoldattachmenlregions，SARs)，是染色质被限制性酶消化后仍然结合在核基质上的DNA序列。目前还没有发现MARs序列具有保守的一致序列，但是它们之间具有一些共有模体，如：A-box、T-box、酵母自主复制序列、果蝇拓扑异构酶II识别位点、弯曲DNA等。近年来的

2、研究发现，MARs能够提高外源基因表达，降低转基因沉默，同时还能使染色质形成环状结构，也可以作为DNA复制的起始点或者调控基因的转录，目前关于MARs的调控机制仍然不清楚。真核生物基因的表达调控主要是顺式作用DNA元件与反式作用蛋白因子的相互作用实现的，因此要研究某--JIM式作用元件的调控机制，必须首先分离与其相互作用的反式作用蛋白因子并研究其功能。能有与MARs序列相结合的蛋白被称作MAR结合蛋白(MAR-bindingproteins，MARBPs)，目前，已经有少量MAR相关的蛋白被克隆出来，但是尚未见到有关单细胞藻类杜氏盐藻MAR结合蛋白的报道。杜氏盐藻(Dunalilla

3、salina)是一种简单的单细胞真核绿藻，没有细胞壁，是一种抗逆性极强的生物，能在NaCI浓度为0．05～5M的培养液中生存。杜氏盐藻为单细胞藻类，没有组织和器官上的特异分化，因此以它为研究材料来研究MARs调控机制有独特的优势。前期工作中，我们构建了杜氏盐藻MAR序列文库，分离出了3个强MAR序列，克隆出一个MAR结合蛋白基因，基因全长1623bp，编码541个氨基酸(GenBankaccessionno：坠Q12垒21§!丛墨曼!Q2墨)。为研究MAR结合蛋白的相关功能，本研究根据GenBank上登录的序列设计特异引物，克隆郑州人学2007年硕+论文杜氏盐藻MAR序列结合蛋白的原

4、核表达及功能初步分析杜氏盐藻MARBP基因全长，构建原核表达载体，转入大肠杆菌工程菌BL2I(DE3)中表达MARs序列结合蛋白，最后利用凝胶滞留试验体外验证它和MARs序列的结合能力。这将为进一步探讨其在体内的生物功能提供可靠的实验依据，同时为研究MARs调控机制奠定基础。一、杜氏盐藻AIhRBP基因的克隆及序列分析1方法1．1杜氏盐藻总RNA的提取采用TIuzol试剂从生长至对数期的杜氏盐藻细胞中提取盐藻总RNA。1．2杜氏盐藻MARBP基因全长的克隆及序列分析根据GenBank上登录的MARBP的eDNA全长设计引物。以杜氏盐藻总RNA为模板，用AMV反转录酶合成cDNA第一链

5、，并以合成的eDNA第一链为模板进行PCR扩增杜氏盐藻MARBP基因的序列全长。PCR产物连接T载体上，测序。测序正确的质粒命名为pMD．MBP。测序结果与GenBank上的MARBP基因序列进行比对分析，并BLAST进行同源性分析。2结果2．1杜氏盐藻总RNA的制备提取的总RNAOD260／OD280在1．8～2．0之间，OD260／OD230大于2．0，说明纯度较高；1％琼脂糖电泳可见28S和18S两条清晰的rRNA条带，且18s与28SrRNA荧光强度比值约为1：2，表明RNA保持较好的分子完整性。2．2杜氏盐藻MARBP基因全长的克隆及序列分析测序分析表明，所克隆序列长162

6、3bp，编码541个氨基酸；BLAST结果显示，该序列与GenBank上登录的杜氏盐藻MARBP的eDNA序列具有99％的同源性，而所编码氨基酸序列之间存在一个氨基酸残基的差异。表明所克隆的序列确实是杜氏盐藻M越国P基因的eDNA序列。二、杜氏盐藻M从s序列结合蛋白原核表达载体的构建及表达1方法1．1杜氏盐藻原核表达载体的构建EcoRI和NdeI双酶切质粒pMD．MBP，胶回收并纯化MARBPeDNA片段，郑州人学2007年硕十论文杜氏盐藻MAR序列结合蛋白的原核表达及功能初步分析同样对pET-28a(+)载体进行EcoRI和NdeI双酶切，纯化回收线性载体片段后，用T4DNA连接酶

7、连接目的基因片段和线状载体，构建杜氏盐藻MARs序列结合蛋白原核表达载体pET-MBP。载体转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，小量提取质粒，用EcoRI和NdeI双酶切鉴定，测序确定读码框是否正确。1．2杜氏盐藻MARs序列结合蛋白在大肠杆菌中的表达将经鉴定读码框正确的重组原核表达载体pET-MBP转化大肠杆菌工程菌株BL21，挑选阳性菌落，接种到5mL卡那霉素浓度为50mg／L的LB培养基中，37。C振荡培养12h，按照1：100的比例接种到新的卡那霉