杜氏盐藻光系统ⅱ反应巾心蛋白d2基因的克隆及序列分析

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1、万方数据第41卷第3期2007年9月华一I·师范大学学报(自然科学I：匣)J()URNAI。oFHUAZHr)NGN()RMALUNIVERSITY(Nal。S扎)V01．4lNo．3SeDt．2007文章编号：10001190(2007)03一043卜06杜氏盐藻光系统Ⅱ反应巾心蛋白D2基因的克隆及序列分析刘红涛，宋建伟，臧卫东，鲁照明，王鹏举，薛乐勋’(郑州大学医学实验中心，郑州450052)摘要：根捌策茵衣藻(血如m州咖口触s撑in^n耐m)、0ryz口mti御、吼，DrEz缸删咖r妇以及Me50盯擅"m0iri出等真核生物的加^

2、D基因的氨基酸高度保守序列．设计一对简并引物，利用TRIz0I试剂提取杜氏盐藻(D删firf缸船￡z胍)细胞的总RNA，通过RlPCR，得到杜氏盐藻cDNA片段的长度大约为1000bp．该序列的PCR产物经T—A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列，Blast同源性分析表明所克隆的基因为杜氏盐藻声56D幕因，编码杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心D2蛋白．该序列已递交GczlBank(GenBank登录号为：【)Q074450)．编码的彝基酸序列，同源性依次为：(Mk聊vdpm唧j陀iⅡ^n耐I"9z％，NP肿msP，Ⅲ括ofi嘲c∞88“

3、，P"Ⅲsm“”如懈￡l88％，A卅一60删如fn抽opadn88％，(麓zd剜缸硎f弘Hs88％．通过密码子偏爱性分析表明．声56D基因存在明显的密码子偏爱性，其(A+T)含量明显高于(G+c)舍最．关键词：杜氏盐藻；1)2蛋白；芦56D；简并引物；密码于偏爱性中国分类号：Q785文献标识码：A高等植物，绿藻和蓝藻通过两个光系统反应中心，光系统I(Photosysteml，PsI)和光系统Ⅱ(PhotosystemⅡ，PsⅡ)，执行产氧光合作用．PsⅡ由叶绿素P680以及与异二聚体D1和D2相关的许多电子受体组成，D1和D2分别由ps

4、M和口s6D基因编码⋯．PSⅡ的组成极其复杂，捕光色素蛋白可能以12聚体形式围绕在PsⅡ光化学反应中心周围，它们吸收光能，并以极高的效率传给光化学反应中心．反应中心色素P680被激发，并发生电荷分离，激发的电子通过电子传递链最后传到黄素蛋白，使NADP+还原形成高能化合物“．PsⅡ反应中心蛋白不仅提供电荷分离反应的场所，而且会直接影响电子的传递效率，其反应中心蛋白D1和D2蛋白组成异二聚体再与PsⅡ反应中心色素一叶绿素P680分子结合，共同构成光系统Ⅱ的光化学反应中心．因此D1蛋白和D2蛋自在光合作用中起着十分重要的作用．由于D1蛋白还

5、是除草剂的结合位点，所以在它被确认为反应中心蛋白以前，对编码它的ps硝收稿日期：2007—0l一22．基金项目：国家自然科学基金资助项目(30600006)*通讯联系人．E-mail：xuelx@371．net．基因已有很多研究．相比之下，对声s6D基因的研究和报道则很少．最近，christopher等人发现在豌豆ps6D基因的5’上游距转录起始位点llOobp区域存在一个类似真核基因增强子的序列，此序列与该基因表达的光调控性质有关。]．所以不论对光合作用机理研究还是叶绿体基因表达调控的研究，声s6D基目的克隆和体外表达研究都有重要价值

6、．杜氏盐藻(D“ndfifz缸mziHn)是一种光合自氧的无细胞擘的单细胞绿藻，是一种抗逆性很强的单细胞真核绿藻，能在O．05～5mol的盐水中生长．繁殖“]．杜氏盐藻的突出优点在于培养条件简单，光合自养，抗逆性极佳．这些特性为利用其进行实验提供了便利．本研究通过比较现有已知物种的户s6D基因的核酸和氨基酸序列设计一对简并引物，采用RT-PcR的方法从杜氏盐藻中克隆了ps一^D基因的cDNA片段，本实验为研究杜氏盐藻PsⅡ的D2蛋白基因上游启动子序列提供的必要的信息．为下一步研究该基因的表达调控打下基础，而且还有利于阐明杜氏盐藻生长过程

7、中叶绿体转录调控及其光合作用的机理．万方数据华中师范大学学报(自然科学版)第4l卷l材料与方法1．1藻株和菌株杜氏盐藻(D“mnfiFf缸sd“n4．U丁EX1644_『跚0)购自美国德州大学(TheunivefsltyofTex-as，usA)．大肠杆菌JMl09为本实验室保存．1．2主要试剂RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；AMvFirststrandcDNAsynthesisKjt购白上海生物工程公司；限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶和pMD】8一T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司(Ta

8、KaRa)；凝胶回收试剂盒和质粒DNA提取试剂盒购自杭州维特洁公司．1．3杜氏盐藻细胞的培养按照5×105细胞／mL的接种量接种于PKs液体培养摹o]，于27℃光照条件下培养，光照强度为4500I，x，明暗