大叶藻zomnhx2基因克隆分析与苹果组培及耐盐初步研究

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1、硕士学位论文大叶藻ZomNHX2基因克隆分析与苹果组培及耐盐初步研究THECLONINGANDANALYSISOFZOMNHX2GENEFROMZOSTERAMARINAANDAPPLETISSUECULTUREWITHAPRELIMINARYSTUDYOFSALT-RESISTANCE卢美凤哈尔滨工业大学2015年6月国内图书分类号：Q37学校代码：10213国际图书分类号：582.261/.279密级：公开理学硕士学位论文大叶藻ZomNHX2基因克隆分析与苹果组培及耐盐初步研究硕士研究生：卢美凤导师：郭长禄副教授申请学位：理学硕士学科：

2、生物学所在单位：海洋科学与技术学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q37U.D.C:582.261/.279DissertationfortheMasteralDegreeinScienceTHECLONINGANDANALYSISOFZOMNHX2GENEFROMZOSTERAMARINAANDAPPLETISSUECULTUREWITHAPRELIMINARYSTUDYOFSALT-RESISTANCECandidate：LuMeifengSupervisor：AssociatePro

3、f.GuoChangluAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchooloftheMarineScienceandTechnologyDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要大叶藻（Zosteramarina）属于大叶藻属（ZosteraL.）海洋高等被子植物，生活在含盐量高达600mm

4、ol/L的海水中，被认为耐盐性很高，这表明大叶藻是研究耐盐基因及耐盐机理的绝佳材料。Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性方面具有重要作用，可以将细胞质内过量的Na+排出细胞或区隔化到液泡中，减少盐离子特别是Na+对细胞的毒害，提高植物耐盐性。本文从大叶藻中成功克隆出液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因（ZomNHX2基因）并对其进行生物信息学分析，通过半定量RT-PCR技术探讨该基因的组织表达特异性。建立苹果组织培养再生体系，为将进一步构建表达载体用于苹果遗传转化，验证液泡膜ZomNHX2基因的功能奠定基础。具体结果如下：1.根据genban

5、k中的序列信息设计特异性引物，通过RT-PCR技术克隆得到大叶藻ZomNHX2基因，长度为1626bp，可编码541个氨基酸。预测蛋白分子量为59.5kDa。2.氨基酸序列比对分析表明，大叶藻ZomNHX2与其他植物的Na+/H+逆向转运蛋白具有较高同源性，其中与马蔺具有最高的同源性。同源比较发现大叶藻ZomNHX2具有Na+/H+逆向转运蛋白基因典型的氨氯吡嗪结合位点保守区域（LFFIVLLPPI）。二级结构预测显示，ZomNHX2的二级结构以α螺旋为主。疏水性分析表明，ZomNHX2的N端具有很强的疏水性，C末端具有较强的亲水性，整个蛋

6、白表现为疏水性。跨膜结构分析推测，ZomNHX2蛋白具有10个跨膜结构域。系统发育树显示大叶藻与马蔺的亲缘关系较近。3.利用半定量RT-PCR技术对大叶藻ZomNHX2基因在茎和叶中的表达特异性进行分析，发现该基因在叶中表达量高于其在茎中表达量。4.建立苹果再生体系。外植体根、茎、叶和子叶在激素诱导下只能形成愈伤组织，而胚芽经MS+KT（1mg/L）+NAA（0.2mg/L）培养基的诱导可高效再生丛生芽。为获得完整幼苗进行生根试验，筛选出最适生根的培养基为1/2MS+NAA（0.2mg/L）。5.苹果幼苗耐盐性研究发现苹果幼苗的盐害率随着N

7、aCl浓度的升高而升高，随着胁迫时间的延长而升高。建议选用4g/L-8g/L的NaCl处理转基因苹果幼苗进行耐盐性分析。-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文关键词：大叶藻；ZomNHX2基因；克隆；表达；苹果组培；耐盐性-II-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractZosteramarinabelongstoZosteraL.,isamarinehigherangiosperm.Zosteramarinalivesintheseawaterwhichcontentssaltashighas600tendency,sothesalt-

8、resistanceofZosteramarinaisconsideredtobewell.Thatconfirmsthatitisaperfectmaterialforther