白氏文昌鱼IKK基因的克隆及其免疫功能分析

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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：f虱孔刍日期：如tj}ts’坫学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、

2、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。(保密论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：Z区盐保密期限为——年。学位论文作者签名：C虱昀指导教师签名：日期：沙啊s、沾Lt期：．土‘摘要形态学以及分子生物学的证据表明文昌鱼是脊索动物中的基底生物，是研究脊椎动物形态、发育以及免疫系统的起源与进化的重要模式生物。随着比较免疫学的迅速发展，以及佛罗里达文昌鱼基因组测序的完成，关于文昌鱼免疫的研究越来越引起人们的关注。因此，本研究在

3、文昌鱼EST数据库的基础上，利用分子生物学方法初步研究了文昌鱼IKK基因在LPS刺激后的免疫应答方面的机制，同时结合进化分析了文昌鱼IKK基因在进化中的地位，本论文主要的研究成果如下：(1)利用RACE对白氏文昌鱼的AmphilKK基因进行克隆，结果表明AmphilKK基因的cDNA序列全长3087bp，其中ORF包含2334bp，预计编码777aa，5’UTR包含164bp，3’UTR包含589bp。(2)经过初步分析表明，AmphiIKK的理论分子量为89．3kDa，等电点为6．26；AmphiIKK与之前发现

4、的IKK蛋白之间存在着43．8％．64．0％的相似性，23．6％．43．3％的一致性。AmphiIKK蛋白具有哺乳动物IKK蛋白一样，具有一个保守的丝氨酸／苏氨酸激酶结构域，在这个结构域中，含有一个丝氨酸／苏氨酸激酶活化位点和一个保守的MAPKK活化茎环。与人类的IKKa和IKKl3比较，文昌鱼IKK蛋白同样具有一个潜在的HLH基序，一个LZ结构，和NBD结构。AmphiIKK蛋白的空间三级结构与其他7个物种的IKK蛋白均相同，均折叠成“手枪”状。系统发育分析表明，AmphiIKK间于无脊椎动物和脊椎动物之间，和合

5、浦珠母贝、太平洋牡蛎等无脊椎动物更为接近。(3)实时定量检测表明IKK基因在所有检测的组织中均表达，其中在肌肉、鳃和脊索中表达最为丰富。在LPS刺激后，AmphilKK在6h有1．46倍的表达量，在8h时有1．80倍的表达量，在12h后趋于平常，表明在外源LPS刺激后文昌鱼IKK基因表现出上调趋势。关键词：文昌鱼；Ird3激酶；NF．r,B：LPS；适应性免疫AbstractBothmorphologicalandmolecularevidenceshowthatamphioxusisthebasalchordat

6、eandisacrucialorganismforunderstandingthechordateevolutionincludingtheoriginoftheimmunesystem，morphologyanddevelopment．Withtherapiddevelopmentofcomparativeimmunology，aswellasthecompletionoftheBranchiostomafloridaegenomesequencing,theattentionWasfocusedonamphio

7、xusimmuneincreasingly．Therefore，thisstudyonthebasisofAmphioxusESTdatabase，usedmolecularbiologymethodstostudyAmphilKKgeneafterLPSstimulationmechanism，whileanalyzedtheAmphilKKgeneevolution．Themainresultsofthethesisareasfollow：(1)TakingadvantageoftheIKKconservedd

8、omainandESTlibraryofamphioxus(Branchiostomafloridae)，wesearched，amplifiedandvalidateda627bpeDNAfragmentfromamphioxus．Basedonthe627bpfragment，a480bpanda2543bpfragmentwereamplifiedby