克氏原螯虾α-淀粉酶基因的克隆与功能分析

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1、摘要克氏原螯虾（Procambarusclarkii）又称小龙虾，在分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲，是一种重要的淡水养殖虾品种。在其整个生命周期中，蜕皮次数高达十几次，且只有经过蜕皮才能实现性成熟。而蜕皮受到多种因素的调控，其中消化酶类扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯虾α-淀粉酶基因并分析了蜕皮激素对α-淀粉酶表达水平的影响。本实验根据已有部分序列，设计特异性引物克隆出克氏原螯虾α-淀粉酶ORF（openreadingframe）cDNA序列。生物信息学分析表明克氏原螯虾α-淀粉酶ORF长1545bp,编码的蛋白质含514个氨基酸残基，其氨基端19个疏水性氨基酸残基为信号肽。预测的

2、成熟蛋白的理论相对分子量为55.1kDa,等电点为4.95.通过双酶切法构建重组质粒pET-28a-amy，转化至E.coliRosetta(DE3)，用不同浓度IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳和Westernblot的检测结果表明克氏原螯虾α-淀粉酶融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达，但是重组蛋白质主要以包涵体形式存在。用Ni-NTA亲和层析柱对α-淀粉酶重组蛋白包涵体进行纯化并免疫制备多克隆抗体，ELISA检测其抗体效价为1:60000。透析法复性纯化后的重组蛋白，DNS法测定其酶活为1425±28U/mg。提取克氏原螯虾肝胰腺、心脏、肠道、胃、肌肉、鳃6个不同组织的总蛋白

3、和总RNA,通过免疫印迹法和实时定量PCR法分析克氏原螯虾α-淀粉酶的组织表达差异。结果表明Pc-amyRNA在各组织中表达量差异显著，在肝胰腺中表达量最高，其次是胃，而其他组织中表达量极低。蜕皮激素刺激48h后Pc-amy表达量明显下降，表明α-淀粉酶能够应答克氏原螯虾蜕皮激素诱导信号。关键词：克氏原螯虾，α-淀粉酶，蜕皮激素，表达IAbstractTheredswapcrayfishProcambarusclarkii,animportantfreshwateraquacultureshrimpspecies,isbelongstoArthropoda,Crustacea,Decapo

4、da.Throughoutitslifecycle,P.clarkiimoltsaboutadozentimesandmaturesafterecdysis.However,ecdysisisregulatedbyvariousfactorsandthedigestiveenzymesplayanimportantroleinthisprocess.Thecloning,expressionandthebiologicalfunctionofα-amylaseinP.clarkiiwereperformedinthisstudy.Oligonucleotideprimersweredesi

5、gnedbyPrimerpremier5.0softwaretoamplifythecDNAfragmentaccordingtopartialknownsequence.BioinformaticanalysisrevealedthattheORFwas1545bpandencodedaproteinof514aminoacidresidueswithasignalpeptide.Thetheoreticalisoelectricpointandmolecularweightofthematurepolypeptideare4.95and55.1kDa,respectively.Phyl

6、ogeneticanalysisshowedthatthePc-Amywashighlyhomologoustoamylasesfromcrustaceans.TheORFwasligatedtopET-28avectorforprokaryoticexpression.TheexpressionplasmidpET-28A-amywastransformedintoE.coliRosetta(DE3)strainfroproteinexpressionbydifferentconcentrationsofIPTG.SDS-PAGEandwesternblotanalysisshowedt

7、hatarecombinantPc-AmyproteinwasexpressedinE.coliandtherecombinantproteinwaspurifiedbynickelaffinitycolumnchromatography.Inordertoobtainpolyclonalantibody,thepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunizeNewZealandra