克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析

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1、中国海洋大学博士学位论文克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析姓名：董超华申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：杨官品;宋林生20090601克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达与功能分析克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析捅要模式识别受体(Patternrecognitionreceptor,PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研

2、究首先在甲壳动物中建立了RNA干扰技术，并利用新建立RNA干扰技术结合基因原核重组、荧光定量PCR等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和f3-1，3一葡聚糖结合蛋白基因以及C一型凝集素基因进行了研究。首先，通过体外转录合成目标基因的双链RNA，将双链RNA注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)个体，建立了稳定RNA干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种RNA干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续96小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。随后

3、，利用RACE(RapidAmplificationofeDNAEnds)技术从克氏原螯虾(ProcambarusclarkiOdfl克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和p．1，3．葡聚糖结合蛋白基因(命名为PcLGBP^)和C一型凝集素基因(命名为P吐EC)。PcLGBP基因eDNA全序列包含一个1107bp的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，编码369个氨基酸。在N末端有一个17个氨基酸的信号肽，表明PcLGBP是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个p一1，3．糖苷键识别序列(Phe235．

4、Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106．108，157．159)和一个N糖基化位点(NRSI66．69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现PcLGBP与甲壳类动物的脂多糖和B．1，3葡聚糖结合蛋白LGBP(Lipopolysaccharideandp—l，3一glucanbindingprotein,LGBP)或p一1，3葡聚糖结合蛋白(B．1，3一glucanbindingprotein,BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negativebacteriaprotein，GNBP)及葡聚糖酶

5、的一致性高于40％。为分析PcLGBP基因的功能，通过半定量RT-PCR方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量PCR技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明PcLGBP基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明PcLGBP基因可能参与螯虾的细菌防御反应。利用酶联免疫法对重组PcLGBP蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达与功能分析PcLGBP蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的13．1。3．葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解Pe

6、LGBP基因在细菌防御中的作用，利用RNA干扰技术沉默尸吐∞P基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。PcLEC基因的eDNA全序列包含一个813bp的ORF，编码271个氨基酸，在N末端有一个17个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在C末端有一个糖识别结构域(Carboh)rdraterecognitiondomain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PeLEC同甲壳动物、昆虫等物种的C型凝集素都有明显的序列

7、相似性。空间结构预测表明，PeLEC与经典的半乳糖结合C．型凝集素具有相似的空间结构，有七个13折叠，2+a螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR技术泖吐EC基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到PcLEC基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增酗cLEC基因的表达。对重组PcLEC蛋白进行凝菌实验表明重组PcLEC对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖Ca