克氏原蟹虾tnfaip8基因的表达特征及功能分析

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1、二零一六年六月万方数据对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日第一导师签名：时间：年月日万方数据摘要克氏原螯虾又称淡水小龙虾

2、，在分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、螯虾科，是我国重要的淡水经济养殖虾品种。在很多地区已形成大规模养殖，但在高温季节尤其是集约化养殖水体中含有大量细菌和病毒很容易引发多种疾病，导致个体的死亡，对其经济收益造成了不利影响。先天免疫是无脊椎动物抵御病原微生物入侵的主要免疫方式，研究无脊椎动物的先天免疫对于阐明其免疫机制具有重要的理论意义，同时对提高其抗病能力及抗病育种具有一定的实践意义。TNFAIP8（tumornecrosisfactorαinducedprotein8）是一个包含有多种蛋

3、白的蛋白质家族,与多种自身免疫性疾病、肿瘤等有关，参与了NF-κB、Toll等多个信号通路的调控。本研究旨在探讨TNFAIP8在克氏原螯虾免疫调节过程中的功能，取得的主要结果如下：1、本实验根据已有部分序列，设计特异性引物克隆了克氏原螯虾肿瘤坏死因子诱导蛋白8（TNFAIP8）基因的开放阅读框序列（ORF，openreadingframe）。该序列长564bp，编码187个氨基酸，预测的蛋白的理论分子量为21.4kDa，等电点为9.038。进化树分析表明克氏原螯虾TNFAIP8基因与无脊椎动物TN

4、FAIP8基因的亲缘关系最近。2、通过双酶切法构建了重组质粒PGEX-4T-3-Pc-TNFAIP8，转化大肠杆菌BL21后采用不同浓度的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳和Westernblot的检测结果表明克氏原螯虾TNFAIP8融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达，获得的重组蛋白分子量大小为40kDa左右，浓度约为1mg/mL。3、利用GSTPull-down技术从克氏原螯虾血淋巴蛋白中筛选鉴定了一个与TNFAIP8相互作用的蛋白—血蓝蛋白（Hemocyanin）。4、提取克氏原螯虾血淋

5、巴细胞、肠、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、心脏7个不同组织RNA，通过荧光定量PCR法分析TNFAIP8基因在不同组织中的表达分布情况，结果表明其在各个组织中均表达，其中在血淋巴细胞中的表达量最高，其次为鳃和肠。5、LPS和PolyI:C刺激后克氏原螯虾血淋巴细胞、鳃、肠中TNFAIP8基因的表达量显著降低，而TNFAIP8重组蛋白诱导和TNFAIP8基因的siRNA干扰处理能够显著影响Toll、Serpin、Bcl、Lectin、TNF等相关免疫基因及Hemocyanin在血淋巴细胞及腮中的表达。综上所

6、述，TNFAIP8基因在克氏原螯虾免疫反应中具有一定的功能。关键词：克氏原螯虾；TNFAIP8；互作蛋白；免疫反应；表达I万方数据AbstractProcambarusclarkii,knownasthefreshwatercrayfishbelongstoArthropoda,Crustacea,Decapoda,Astacidae,isanimportanteconomicallycultivatedfreshwaterspeciesinourcountry.Duetothehightempe

7、ratureandwatercontainingalotofbacteriaandvirusesduringtheintensiveaquaculture,diseasesoccurredandcausedthedeathoftheindividualwithmajoreconomicloss.Innateimmunityisthemainimmunesystemofinvertebratestodefensetheinvasionofpathogenicmicroorganisms.Clarif

8、icationoftheimmunemechanismofinvertebratesagainstmicroorganismsareusefulfortheimproveme-ntoftheoryandprovideinsightinthebreedingofdisease-resistantspecies.Tumornecrosisfactor-α-inducedprotein8(TNFAIP8)isafamilyofproteinsthatcontainavarietyofpr