青海血蜱cdna表达文库的免疫筛选及基因克隆表达

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1、摘要青海m蜱(Haemaphysalisqinghaiensis)及其传播的疾病严重威胁着我国肖牧业的发展。嚣蓠，对蜱数控制方法主要是瘦熙讫学药物灭蜂，但随着蜱耐药性的产生驭及环境污染和药物残留等严熏公共至垒阀题静出现追使久们寻求防治熟新途径。在众多控翻孵的方法审，免疫学醛裁是前景墩诱人的方法之一。将青海盔簿成蜱cDNA表达文痒与宿主蕾BL21(DE3》丑ysE按一定毖捌混合照鬻并镶嫒，警理斑出现盾将Nc膜覆盖于顶廉胶表面并继续培养3。5h。随厩，将此Nc膜依次与抗青海血蛑幼蟀阳性血清翱碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG反应，最厝加底物攫色，初步筛选得到蓝紫色的阳性克隆，并簧簿直至整

2、个貘上均为阁性信号为盘。用所得麓萑噬菌俸转染窝变菌BM25．8使之童动耍克隆为熏组质粒，用此亚克隆质粒转化宿主菌JMl09并从中提取重组质粒进行PCR和测序。序列分辑结巢表鞠：共获得lO个蒸困，分舅g命名为№醵一l、№强屹、HqLA-3、№LA一4、HqLA一5、HqLA-6、HqL矗-?、HqLA-8、HqLA-9释瀚LA—lO，它们酶大小分掰寿798bp、421bp、637bp、392bp、297bp、1473bp、626bp、201bp、989bp和551bp。其中HqLA～1～HqLA～9为青海赢蜱所固有的新发现蒸因，提交至GenBank／戳8i获取廖列号，序列号分象舞

3、FE674076、FE674077、FE674078、惩67鲻8唾、FE674079、FE674080、FE674081、FE674082和FE674083。其中HqLA一2、HqLA-6、HqLA-7、HqLA：9和HqLA-IO共5个基因成功进行诱导嶷达，表达产物的分子嫠为47kDa、87kDa、48kDa、57kDa帮6繇溉。裁蔫表达产耪蛋囱能与抗青海盘蜂戆簿嘲往盘清发生免疫学反应，发现基露HqLA-7、HqLA-9的表达产物县有较好的反应原性。这为研制青海血蜱的分予疫苗奠定了基础。本磷究剩曩兔抗青海囊蜱幼蜱阳{生巍潼对己梭建兹青海斑蜱残蟑eDNA表达文痒《裹金尧构建)送

4、行免疫学筛选，煲

5、j所获得抗原基霞在理论上对青海盘蛑幼簿帮青海矗蛑成蛑均其有保护性。关键词毒海盎蜱幼辫鞠性盘渣；青海盎薄藏鳞cDNA表达文库；表达；AbstractHaemaphysalisqinghaiensistickandtheprotozoaldiseasesthattransmittedbyitaremajoreconomicburdentoanimalhusbandryinChina．Currentlytheprincipaltickcontrolmethodistheapplicationofacaricides。Thisapproachis，howevegass

6、ociatedwithanumberofdisadvantagessuchaschemicalpollutionofthefoodchainandtheenvironmentaswellasthepotentialfordevelopmentofresistanceagainstacaricidesbyticks．Theselimitationshavenecessitatedthesearchforalternativetickcontrolmeasures。Onlyanti—tickvaccinationamongtheseveralalternativetickcontr

7、olmeasuresappearspromising．RecombinantphageswereplatedonahostBL21(DE3)pLysE，andwhenplaquesbegaintoform，theplateswereoverlaidwithnitrocellulosefiltersandincubatedforalladditional3．5hours．ThefilterswereprocessedbysuccessiveincubationswithpositiveserumofrabbitagainstHaemaphysalisqinghaiensislar

8、valtick，sheepanti—rabbitIgGalkalinephosphataseconjugate，andcolordevelopmentsubstrateshndthuspositiveplaqueswithintenseptirplecolorvcerefound．PurephagestockswereobtainedbyplaquepurificationandconvertedtoplasmidsubclonesbyplatingphageonhoststrainBM25