幽门螺杆菌cagpai基因cagx功能的实验的研究

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2、不保密口。学位论文作者签名：南。蚨珈If年‘月J弓日指导教师签名：矽11年幽门螺杆菌cag．PAI基因cagX功能的实验研究STUDYONTHEFUNCTIoNOFCAGXGENEoFTHECAG．PAJINHELICOBACTERPYLoRI2011年6月江苏大学硕士学位论文摘要目的：构建ffaf31．i杆菌(Helicobacterpylori,Hpylori)cagPAI中基因cagX缺失株，探讨该基因对cagY、cagW、cagN基因表达的影响、在CagA转运过程中的作用及对细胞GES．1

3、IL-8mRNA表达能力的影响；提取并纯化CagX重组蛋白，免疫BAI_B／c小鼠，制备多克隆抗体，明确CagX的亚细胞定位及与尿素酶、过氧化氢酶等的关系。为深入探讨幽门螺杆菌的致病机制研究奠定基础。方法：1．根据GenBank中收录的且pylori26695全基因组序列，设计扩增cagX基[]缺失株的同源臂引物，用PCR方法从H／：,y／or／NCTC11637基因组DNA中扩增c口g堪因同源臂片段，将克隆片段连-至pMDl8．T载体，转化大肠杆菌DH5a，再将片段定向插入含卡那抗性pBlueK

4、M40载体中，经酶切鉴定分析，将自杀质粒命名为pBlueKM40一AcagX；2．构建好的自杀质粒与且py／or／11637转入电击杯，利用同源重组原理，构建cagX基因缺失株，自杀质粒电击转化进入幽门螺杆菌，通过抗生素平板进行传代筛选，通过PCR方法验证cagX基因缺失株Hpylori11637AcagX的获得，提取cagX基因缺失前后细菌总RNA，逆转录为eDNA，以eDNA为模板PCR检测基因cagY,cagW,cagN的表达；3．将cagX基因缺失株和野生株与正常胃上皮细胞GES一1进行共

5、培养，然后采用Westernblot的方法检测Hpylori转运CagA蛋白的能力，提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR检测IL-8mRNA的表达；4．将原核表达的CagX蛋白用Ni2+-NTA柱进行分离纯化，纯化的蛋白CagX与弗氏佐剂充分乳化后，免疫BALB／c小鼠，制备多克隆抗体，酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)检测血清中抗体效价；5．收集且pylori，重悬并裂解菌体，收集细菌总蛋白，经超高速离心分离得到菌体各组分蛋白，包括

6、周质间隙蛋白、胞质蛋白及内外膜蛋白，利用WesternBlot法检测CagX蛋白的亚细胞定位；细菌总蛋白再与proteinA／Gplusagarose珠子混合，利用CagX抗体分离出相关蛋白，SDS．PAGE分析与CagX相关的蛋白；幽门螺杆菌cag-PAI基因cagX功能的实验研究结果：1．经过PCR及与载体连接，成功构建了幽门螺杆菌cagX基因的自杀质粒pBlueKM40--AcagX，经电击转化抗生素筛选获得了cagX基因的缺失株。2．提取且pylori野生株及cagX基因缺失株总RNA，逆

7、转录为eDNA，并以其为模板检测cagX上下游基因cagW、cagT伴侣蛋白cagN基因表达变化，结果显示cagX基因缺失后，上下游基因表达量均受到影响，而cagN基因表达并没有变化。3．将野生株与cagX基因缺失株分别与正常胃上皮细胞GES．1共培养后，Westernblot检测结果发现，cagX基因缺失株处理组中未检测到的CagA的转运，而野生株中CagA转运成功。4．野生株与cagX基因缺失株分别与正常胃上皮细胞GES．1共培养后，提取细胞的总RNA逆转录成eDNA后，RT-PCR检测细胞因

8、子ID8mRNA的表达，结果发现cagX基因缺失后IL-8mRNA表达受到影响；5．cagX-pET32a原核表达重组质粒，在浓度lmmol／LIPTG，温度30℃，诱导时间4h条件下诱导，利用Ni2+_NTA柱进行分离纯化；纯化的CagX蛋白免疫BALB／e小鼠，获得CagX融合蛋白多克隆抗体，效价为1：3．2x105；WesternBlot结果显示CagX蛋白定位于菌体内外膜；免疫共沉淀及质谱结果发现，CagX与尿素酶、过氧化氢酶等有关。结论：成功构建了cagX基因自杀质粒及缺