幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能的初步研究

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1、福建医科大学硕士学位论文幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能的初步研究姓名：林梨平申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：佘菲菲20090301幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能初步研究中文摘要背景与目的：幽门螺杆菌(Yelicobacterpylori，Hp)是定植于胃粘膜表面的革兰氏阴性、生长缓慢的螺旋状微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子，并且与胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关。Hp的致病性已得到公认，但其致病的机制及感染结局的多样性的本质仍未阐明。近年来，人们丌始将寻找Hp致病特异基因的目标投

2、向其“可塑区”。jhp947基因是位于J99可塑区上的基因，国外文献报告jhp947基因是Hp的一种新的致病因子，与胃癌、消化性溃疡等疾病关系密切。因此，本研究通过比较jhp947基因缺失突变株及其相应野生株J99菌株的主要毒力活性差异及其对宿主细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的影响，初步评价与Hp可塑区jhp947基因相关的生物学作用及其在细胞水平的毒性以及对细胞因子IL-8、IL一12分泌的影响，为揭示jhp947基因参与Hp致病过程的分子机制，探索其与消化性溃疡、胃癌的相关性提供实验依据。方法：l、jhp947基因缺失突变株J9

3、9—947△的主要毒力活性检测。1．1应用尿素酶试剂，检测947基因敲除突变株J99—947△与标准株J99的尿素酶活性差异。1．2采用0．3％半固体琼脂穿刺法比较突变株与标准株的移行能力差别。1．3采用体外细胞(GES-1细胞)粘附实验检测突变株与标准株的粘附作用差异。1．4突变株和标准株培养上清以不同滴度作用于GES-1细胞，镜下观察细胞空泡样变，并结合中性红摄入法定量检测各组空泡毒素活性。2、J99-947a对GES-1细胞增殖与凋亡的影响。2．1标准株、突变株分别与GES-1细胞共培养48h，倒置显微镜下观察细胞形态学变化

4、。2．2CCK一8比色法检测标准株、突变株与GES-1细胞共培养24h，对细胞增殖活性的影响。2．3流式细胞仪检测标准株、突变株与GES-I细胞共培养24h的细胞凋亡情况。3、J99—947△对细胞因子IL一8、IL—12分泌的影响。3．1标准株、突变株分别与AGS细胞共培养24h后，收集上清测定IL一8。3．2从正常人外周血中分离培养鉴定树突状细胞。3．3标准株、突变株分别与未成熟树突状细胞共培养48h后，收集上清测定IL一12。3．4标准株、突变株分别与THP一1单核细胞共培养24h后，收集上清测定IL—12。结果：1、jhp

5、947基因缺失突变株J99—947△的主要毒力活性。1．1尿素酶活性标准株组和突变株组在细菌与尿素酶试剂作用后，即刻会引起明显的颜色变化，两组均在20min即分解完全尿素酶试剂达到最大吸光度值，两组在5-30min4个时点的吸光度值均无明显差异(p>O．05)，提示jhp947基因缺失对Hp尿素酶活性没有影响。1．2Hp移行能力在0．3％半固体布氏平板上培养3d后，标准株从穿刺位点处向周围区域扩散开(平均直径10．3士1．0ram)，突变株形成菌落集群平均直径(9．5士1．3ram)，二者差异无统计学意义(p>0．05)，提示jh

6、p947基因缺失对Hp移行能力没有影响。1．3J99和J99—947△均能粘附于GES—l细胞表面，在MOI为i00：1，粘附2h后细胞周围粘附的细菌数分别为65±18、58±15，两者之间差异无统计学意义(P>0．05)，提示jhp947基因缺失对J99对细胞的粘附能力没有影响。1．4标准株J99组和突变株J99-947△组空泡试验阳性的滴度均为l：8，且空泡形成的特点相近。进一步结合中性红摄入法定量评价空泡毒素活性，结果发现，947基因敲除突变株与其亲本野生株的空泡毒素活性没有明显差别，提示947基因敲除并不影响VacA活性。

7、2、J99—947△对胃上皮细胞株GES-I细胞增殖和凋亡的影响。2．1幽门螺杆菌标准株组J99对GES．1细胞具有损伤作用，随着作用时间的延长。GES．1细胞形态由贴壁的梭形变为圆形，细胞核染色质浓缩，呈新月形聚集于核缘，细胞质浓缩，可见空泡变性，死亡细胞逐渐增多。突变株组细胞也出现2与标准株组类似的细胞形态学变化。2．2CCK一8试验显示，Hp与细胞共培养24h后，MOI为2：1，4：1，标准株和突变株组均对GES-1细胞有促增殖作用，当MOI为4：1时，标准株和突变株组对GES-1细胞的促增殖作用最为明显，具有统计学意义(p

8、<0．05)。而标准株组与突变株组组之间差别无显著性(p>O．05)。2．3流式细胞分析显示，在攻击细胞，标准株和突变株均可引起细胞凋亡，凋亡率分别为15．3％和14．2％，均高于对照组凋亡率1．7％(p<0．05)，但两实验组差别无统计学意义。3