幽门螺杆菌ⅳ型分泌系统cagx基因的克隆及生物信

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1、幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信【摘要】目的：构建表达幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）NCTC11637IV型分泌系统cagX(HP0528)全长编码基因的原核表达载体。方法：用PCR方法从H.pylori基因组DNA中扩增cagX编码基因片段，将cagX克隆至pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，再将其定向插入pET32a(+)载体中，经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果，并进行序列测定和生物信息学预测。结果：克隆幽门螺杆菌NCTC11637cagX基因全长1569b

2、p（基因库登录号为EF608160），编码522个氨基酸，融合蛋白的相对分子质量约为80.5kD。与基因库公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为96%～99%。预测结果显示H.pylori11637，26695，J99间二级结构有一定差异，但抗原性相同。结论：成功克隆并表达了H.pyloriNCTC11637cagX基因，并对其生物学特征进行了预测，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。【关键词】幽门螺杆菌；cagX；IV型分泌系统；生物信息；序列分析［Abstract］Objective:Theprokaryotice

3、xpressionvectorforgeneencodingthefusionproteincagXoftypeIVsecretionsystem(TFSS)plifiedbyPCRusingthegenomeDNA.ThePCRproductedintoE.coliDH5α.Thepositiverebinantcloneentinoacid,ethodandolecularatelyabout80.5kD.GenBankaccessionnumberisEF608160.ThesequenceanalysisforcagXshoo

4、logy；bioinformatics；sequenceanalysis　　幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一种定植于人类胃粘膜的螺旋状、革兰阴性微需氧菌，现已被公认为慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要病因，并与肠型胃癌及胃MALT淋巴瘤的发生密切相关［1-3］。I型H.pylori菌株中含有一个约40kb的cag致病岛（cytotoxinassociatedgenepathogenicityisland，cagPAI)。cag致病岛基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统（typeIVsecreti

5、onsystem,TFSS）。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens，A.tumefaciens）的VirB-VirD系统或称Ti-DNA输送系统被公认为是TFSS的标准，它是由VirB操纵子的产物（VirB1-VirB11蛋白）和VirD4基因编码的产物VirD4装配而成，形成跨膜通道将蛋白直接注入宿主细胞内［4］。H.pylori中VirB9的同系物cagX/HP0528由cag致病岛编码，Tanaka等［5］用免疫金标记扫描电镜技术发现，VirB9的同系物HP0528/CagX定位于H.pylori的外膜上

6、，沿着菌毛的长度定植，并与HP0532/CagT通过分子间二硫键交联形成外膜复合物。　　本文首次报道了H.pyloriNCTC11637cagX基因全序列，并对cagX序列进行了生物信息学比较分析，为进一步研究cagX基因的生物学功能奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌株及质粒H.pyloriNCTC11637购自中国预防科学院流行病学研究所；大肠埃希菌DH5α，BL21，pET32a(+)载体由江苏大学医学技术学院中心实验室保存；pGEM-T载体购自Promega公司。　　1.1.2试剂和仪器哥伦比亚培养基、厌氧

7、袋（Oxoid公司）；Ex-TaqDNA聚合酶，dNTPs，T4DNA连接酶（快速连接试剂盒）TakaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0，DL2000DNA标准参照物，λ-EcoT14IdigestDNA标准参照物（TakaRa公司）；限制性核酸内切酶EcoRI及SalI（Fermantas公司）；DL3000DNA标准参照物（上海伯叟生物科技有限公司）；1kbDNALadder（Toyobo）；PCR基因扩增仪（MastercyclerGracent,Eppendor公司）、自动凝胶成像系统（美

8、国UVP公司），其他常规试剂按照《分子克隆实验指南》要求配制。　　1.2方法　　1.2.1H.pylori基因组DNA提取H.pyloriNCTC11637标准菌株按常规微需氧方法培养。刮取96h培养的菌落，按以下步骤提