泛素特异性蛋白酶usp46的分子克隆

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1、弭艺￡．1j■j／目录lUlIIIIIIIIIIIIY1779906中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文泛素特异性蛋白酶USP46的分子克隆前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．10一刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40综述泛素化和去泛素化系统与疾病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44致谢⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57＼中文摘要泛素特异性蛋白酶USP46的分

3、子克隆摘要目的：泛素．蛋白酶体途径(Ubiquitinproteasomepathway，UPP)是细胞内一个重要的蛋白质降解调控系统。通过对底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解，参与调控细胞周期、基因转录、免疫反应、肿瘤生长和炎症等众多的细胞进程。该途径也是一个被严格调控的可逆过程，其中去泛素化酶的调节就是一个重要的环节。目前研究证实，细胞内广泛存在多种去泛素化酶(Deubiquitinatingenzymes，DUBs)，人类基因组共编码95种去泛素化酶，按结构不同分为5种类型。包括泛素特异性蛋白酶(USPs)，泛素

4、羧基末端水解酶(UCHs)，Machado．Josephdiseaseproteindomainproteases(MJDs)，卵巢肿瘤相关蛋白酶(OTUs)，和MPN(+)／JAMM蛋白酶(JAMMs)。USPs为去泛素化酶中成员最多，且结构最具多样性的一类，它主要通过底物蛋白的去泛素化调控蛋白质的半衰期，从而实现其生理功能。目前研究发现，USP与多种疾病有关。jtNUSP2a在前列腺癌中具有抗凋亡作用；UCH．L1基因突变是常染色体显性遗传性帕金森病的致病基因之～；HAUSP(USP7)通过对其底物抑癌基因p5

5、3的去泛素化抑制肿瘤细胞的生长。在本课题研究过程中，有文献报道usp46为悬尾试验(TailSuspensionTest，TST)和强迫游泳试验(ForcedSwimmingTest，FST)中调节小鼠不动行为的数量性状基因。研究发现CSd,鼠usp46第92号赖氨酸缺失是造成小鼠不动时间短于C57BL／6Jd、鼠的主要原因，而将野生型usp46转入CS基因小鼠后不动时间明显增加，因此提出USP46与行为抑郁有关的假说。本研究通过对usp46基因的克隆，了解usp46在不同组织中的分布情况，建立去泛素化酶活性检测体

6、系，通过检测USP46和第92号赖氨酸去除后USP46(△K92)去泛素酶活性变化等，为抑郁症的病因学研究提供线索，同时为去泛素化酶的分子流行病学研究奠定基础。方法：(1)运用分子克隆的方法克隆大鼠usp46基因。采用TRIzol裂解法0●)中文摘要提取大鼠脑组织总RNA，运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得usp46。将usp46基因克隆至pGEM．Teasy载体，通过蓝白斑筛选实验确定阳性克隆并应用碱裂解法提取质粒，进行双酶切鉴定及测序分析。(2)采用荧光定量PCR(Real．TimeImPCR)2

7、出Q相对定量方法检顿?Jusp46在大鼠骨骼肌、脑组织、心脏、脾脏、肾脏、肝脏、肺脏中的相对表达水平。以GAPDH基因作为参照样本，校正标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异进行标准化。以usp46在脑组织中的表达水平作为校准样本比较各组织中卿彳6表达水平的差异。(3)将usp46基因克隆Np6EX．6p．1原核表达载体，在大肠杆菌DH．5et中表达，获得带有GST标签的70KD左右的USP46融合蛋白，同时检测融合蛋白GST-USP46可溶性。(4)构建去泛素化酶活性检测体系，并检测大鼠USP46去泛素化酶活性。

8、USP表达质粒与模型底物(GST-Ub52)表达质粒pGEX．Ub52经IPTG诱导后共表达，研究去泛素化酶的活性。采用定向克隆的方法构建pAC．T7质粒、pAC．T7．usp46质粒。以GST-Ub52做为模型底物，分子量为45KDa，去泛素化后分子量为36KDa。以去泛素化酶UBP2作为阳性对照。用GSH．Sepharose．TMResin纯化蛋白系统纯