亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的干预作用

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1、中文摘要亚低温对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的干预作用摘要目的：近年来，随着临床急救水平的提高，一些心肺复苏、心肌梗塞、休克、窒息等危重病人存活率逐渐提高，这些疾病所造成的全脑缺血损伤以及缺血后再灌注损伤已成为研究热点。其中，脑缺血及再灌注后如何减少神经元死亡一直是临床研究的难点。许多学者经过一系列脑缺血动物模型研究，从形态学、生化等多角度证实凋亡存在于脑缺血再灌注损伤中。探讨如何有效抑制凋亡是减轻脑缺血再灌注损伤的一个重要环节。目前，脑保护剂虽然应用多年，但至今仍没有一种药物能通过Ⅲ期临床的研究。而亚低温保护技术在各种解决方案中具有自己的特色和优势。亚低

2、温作为一种非药物性脑保护疗法，与药物治疗比较具有一定的优越性，它可以干预脑缺血再灌注的多个病理环节，对脑缺血及再灌注损伤起到保护作用。本研究通过观察亚低温对脑缺血及缺血再灌注损伤后细胞凋亡及Bel-2、Bax表达的影响，旨在为临床应用提供可靠的实验依据。亚低温按应用时机可分为缺血后即刻亚低温和再灌注后不同时间点亚低温，本实验对亚低温作用的不同时间窗进行凋亡百分率及Bel-2、Bax表达测定，在国内进行较少，为前沿性的研究，具有一定的理论指导价值。方法：l动物与分组：成年健康清洁级WiStar大鼠42中文摘要只，雄性，体重250．2809。随机分为3组，即假手术组(

3、S．6只)，对照组(C，6只)，亚低温组(M，30只)。其中亚低温组根据全脑缺血后给予亚低温的时间点不同又分为5组，即缺血后即刻给予亚低温组(M1)；缺血再灌注后0小时组(M2)；6小时组(M3)；12小时组(M4)：24小时组(M5)，每组均为6只大鼠。2模型制作：采用大鼠四条血管阻断方法(PulSinelli-4VO法)制备大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠用10％水合氯醛(350Mg／kg)腹腔注射麻醉，电凝双侧锥动脉，次日夹闭两侧颈总动脉15分钟，恢复再灌注。对照组和亚低温组均采用四血管阻塞法制备大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅切开颈部皮肤和肌层暴露双侧椎

4、动脉和颈动脉，但不阻断血管。假手术组和对照组置于室温下。并维持大鼠肛温在(37±0．5)℃。亚低温组于缺血后的不同时闻点给予亚低温。3标本制作：于再灌注及假手术组术后48小时麻醉动物(10％水合氯醛腹腔注射，350Mg／kg)，断头取脑，分离海马组织置于70％酒精中40C保存待检。4流式细胞分析仪检测：①将固定或新鲜的组织放在120目不锈钢网上置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以500--800转／分钟，离心沉淀2分钟；②细胞DNA含量的染

5、色：取1×1050．1ML，加入10％鸡红细胞作为内参标准，与样品同步染色，加入碘化丙啶(PI)(PI：50Mg／L,triton-x1001．O％)1ML，在4"C冰箱染色30分钟，以500目铜网过滤，使样品成为合格单细胞悬液，即可上机检测；⑨细胞的免疫荧光标记：取单细胞悬液l×10％,m，中文摘要加入鼠抗人单克隆抗体工作液0．1ML，室温孵育30分钟，加入PPSl0ML洗涤一次，弃上清液，加入羊抗鼠FITC--LgG二抗，上机检测前加入PBS0．1ML，经500目铜网过滤后上机检测；④采用美国BeCkManCoulter公司生产的EPICS．XLⅡ型流式细胞仪

6、，激发光源为15MW氩离子激光器，激发波长为488nM，应用ExPo32ADC进行免疫荧光数据分析，用MutiCyCleAV分析软件对DNA细胞周期拟和分析。5统计学分析：数据均以(均数±标准差)(；士S)表示。采用SPSSl4．0统计软件单因素方差分析比较组间差别，两两比较时首先检验方差齐性。方差齐时运用LSD-t检验，方差不齐时用DurmettS’SC法进行统计学分析。P<0．05为有统计学意义。结果：l凋亡百分率：各组经方差分析检验，F值为142．869，P值远小于0．01，表明各组及亚组间差异显著。S组细胞凋亡百分率为(2．3l±0．43)，明显小于其余各

7、组；C组细胞凋亡百分率为(15．12±1．99)，明显大于其余各组；M各亚组比较，细胞凋亡百分率分别为M1组(8．74±O．51)，M2组(3．53±0．23)，M3组(4．97：L0．21)，M4组(6．34tq)．84)，M5组(9．21zq)．St)；M2组最低，M5组最高；M1组与M5组比较，P值为0．363，大于0．05，差异不显著。其余各组两两比较，P值均小于0．05，差异显著。2增殖指数(PI)：各组经方差分析检验，F值为153．993·，P值远小于0．01，表明各组及亚组间差异显著。S组增殖指数(49．304-2．42)，数值最高；C组为(8．77

8、士1．24